專利名稱：編碼g蛋白偶聯(lián)受體的基因及其使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明總的來講涉及神經(jīng)科學(xué)、生物信息學(xué)和分子生物學(xué)領(lǐng)域。更具體地講，本發(fā)明涉及新鑒定的編碼G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)的多核苷酸、所述多核苷酸和多肽的應(yīng)用、以及所述多核苷酸和多肽的生產(chǎn)。本發(fā)明還涉及鑒定可以作為GPCR的激動劑、拮抗劑和/或抑制劑、并因此可能用于治療的化合物。
背景技術(shù)：
已經(jīng)確定，許多在醫(yī)學(xué)上重要的生物過程由參與細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的多肽介導(dǎo)，所述細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑涉及G蛋白和第二信使，所述第二信使如cAMP、IP3和二酰甘油(Lefkowitz，1991)。這些多肽的某些實(shí)例包括G蛋白本身(例如G蛋白家族I、II和III)；G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)，例如生物胺遞質(zhì)(例如腎上腺素、去甲腎上腺素和多巴胺)的受體(Kobilka等，1987(a)；Kobilka等，1987(b)；Bunzow等，1988)、效應(yīng)物多肽(例如磷脂酶C、腺苷酸環(huán)化酶和磷酸二酯酶)的受體以及actuator多肽(例如多肽激酶A和多肽激酶C)的受體(Simon等，1991)。
細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的一種特定途徑是肌醇磷脂途徑。在該途徑中，細(xì)胞外信號分子(例如腎上腺素)結(jié)合G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)，該過程激活GPCR。GPCR隨后結(jié)合由α、β和γ多肽亞基組成的特異性三聚體G蛋白。在GPCR/G蛋白結(jié)合狀態(tài)下，G蛋白α亞基上的GDP被GTP交換，導(dǎo)致α亞基與β/γ亞基解離。結(jié)合GTP的α亞基是所述多肽的活性狀態(tài)。所述有活性的α亞基進(jìn)一步激活磷脂酶C，磷脂酶C催化切割PIP2成為IP3和二酰甘油(DAG)。所述IP3和DAG作為進(jìn)一步信號擴(kuò)增(例如釋放Ca2+和磷酸化)的第二信使。G蛋白本身催化GTP水解成GDP，使G蛋白回復(fù)其基本的無活性形式。由此，GPCR結(jié)合信號分子后，激活G蛋白。所述G蛋白有雙重作用，一是作為從受體傳遞信號到效應(yīng)物的中間體，二是作為控制所述信號持續(xù)時(shí)間的時(shí)鐘。
GPCR是膜結(jié)合蛋白，包括特征在于具有七個(gè)推定的跨膜結(jié)構(gòu)域的基因超家族。在細(xì)胞內(nèi)，GPCR可以通過異三聚體G蛋白與各種胞內(nèi)酶、離子通道和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白偶聯(lián)(參見Johnson等，1989)。不同G蛋白α亞基優(yōu)先刺激特定效應(yīng)物，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)各種生物學(xué)功能。
偶聯(lián)受體的G蛋白家族包括各種各樣的生物活性受體，例如激素受體、病毒受體、生長因子受體和神經(jīng)受體。該家族成員的實(shí)例包括但不限于多巴胺、降鈣素、腎上腺素能藥物、內(nèi)皮縮血管肽、cAMP、腺苷、毒蠅堿性乙酰膽堿、5-羥色胺、組胺、凝血酶、激肽、促卵泡激素、視蛋白、內(nèi)皮分化基因-1、視紫紅質(zhì)、添味劑(odorant)和巨細(xì)胞病毒受體。
人們認(rèn)為，所述七次跨膜GPCR結(jié)構(gòu)域代表通過胞外環(huán)或胞質(zhì)環(huán)連接的跨膜α螺旋。已經(jīng)鑒定GPCR的特征是包括這些七個(gè)保守的長約20-30個(gè)氨基酸的疏水性序列段，連接至少八個(gè)趨異的親水性環(huán)。大多數(shù)GPCR(也稱為7TM受體)在前兩個(gè)胞外環(huán)的每個(gè)環(huán)上都具有一個(gè)保守的半胱氨酸殘基，這兩個(gè)半胱氨酸殘基形成二硫鍵，相信其作用是穩(wěn)定功能性多肽結(jié)構(gòu)。所述7個(gè)跨膜區(qū)命名為TM1、TM2、TM3、TM4、TM5、TM6和TM7。由于TM3具有配體結(jié)合位點(diǎn)例如TM3天冬氨酸殘基，因此懷疑其涉及幾種GPCR。TM5絲氨酸、TM6天冬酰胺和TM6或TM7苯丙氨酸或酪氨酸也懷疑涉及某些受體家族的配體結(jié)合。
半胱氨酸殘基的磷酸化和脂質(zhì)化(棕櫚基化或法尼基化)可能影響一些GPCR的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。大多數(shù)GPCR在第三個(gè)胞質(zhì)環(huán)和/或羧基末端內(nèi)含有可能的磷酸化位點(diǎn)。對于幾種GPCR如β-腎上腺素受體，多肽激酶A和/或特異性受體激酶引起的磷酸化介導(dǎo)受體脫敏。
目前，已經(jīng)克隆來自各種真核物種的超過800種GPCR，其中140種是已知其內(nèi)源受體的人GPCR(Stadel等，1997)。此外，幾百種靶向GPCR的治療劑已經(jīng)成功投放市場，治療各種適應(yīng)征，所述GPCR如血管緊張肽受體、降鈣素受體、腎上腺素受體受體、5-羥色胺受體、白三烯受體、催產(chǎn)素受體、前列腺素受體、多巴胺受體、組胺受體、毒蠅堿性乙酰膽堿受體、阿片樣物質(zhì)受體、促生長素抑制素受體和血管升壓素受體(參見Stadel等，1997)。這表明這些受體有作為治療靶的確定并且被證實(shí)的歷史記錄。對GPCR基因的搜索也鑒定出許多這樣的基因所述基因的基因產(chǎn)物是GPCR家族成員，但未知它們的天然配體，這些GPCR家族成員一般被稱為孤獨(dú)受體。事實(shí)上，在已經(jīng)鑒定的240種人類GPCR中，超過100種(即約45％)是孤獨(dú)受體，估計(jì)至少還有超過400-1000種尚未鑒定的GPCR基因(Stadel等，1997)。
因此，明顯需要鑒定和表征能夠預(yù)防、緩解或矯正功能障礙或疾病的其它孤獨(dú)GPCR、它們的基因和它們的配體，所述功能障礙或疾病包括但不限于感染如細(xì)菌感染、真菌感染、原生動物感染和病毒感染，尤其是HIV-1或HIV-2引起的感染；疼痛；癌癥；厭食癥；貪食癥；哮喘；帕金森??；急性心力衰竭；低血壓；高血壓；尿潴留；骨質(zhì)疏松癥；心絞痛；心肌梗塞；潰瘍；哮喘；變態(tài)反應(yīng)；良性前列腺增生；以及精神神經(jīng)疾病，包括焦慮、神經(jīng)分裂癥、躁郁癥、譫妄、癡呆、嚴(yán)重智力遲鈍和運(yùn)動障礙，例如亨庭頓病或圖雷特綜合征。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及新鑒定的編碼G蛋白偶聯(lián)受體(本文稱為GPCR)的多核苷酸、所述多核苷酸和多肽的應(yīng)用、以及所述多核苷酸和多肽的生產(chǎn)。本發(fā)明還涉及鑒定可以作為GPCR的激動劑、拮抗劑和/或抑制劑、并因此可能用于治療的化合物。
在具體實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及分離的多核苷酸，所述分離的多核苷酸包含編碼以下多肽的核酸序列所述多肽包含SEQ ID NO4的氨基酸序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述多核苷酸還包含編碼異源蛋白的核酸序列。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及重組表達(dá)載體，所述重組表達(dá)載體包含具有以下核酸序列的多核苷酸所述核酸序列編碼包含SEQ ID NO4的氨基酸序列的多肽。在某些實(shí)施方案中，所述多核苷酸包含SEQ ID NO1、SEQ ID NO2或SEQ ID NO3的核酸序列。在某些其它實(shí)施方案中，所述多核苷酸選自DNA、cDNA、基因組DNA、RNA、pre-mRNA和反義RNA。在其它實(shí)施方案中，所述載體DNA選自質(zhì)粒、附加型載體、YAC和病毒載體。在又一個(gè)實(shí)施方案中，所述多核苷酸有效連接一種或多種選自以下的調(diào)節(jié)元件啟動子、增強(qiáng)子、剪接信號、終止信號、核糖體結(jié)合信號和聚腺苷酸化信號。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及用重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)化或感染的基因工程宿主細(xì)胞，所述重組表達(dá)載體包含具有以下核酸序列的多核苷酸所述核酸序列編碼包含SEQ ID NO4的氨基酸序列的多肽。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述宿主細(xì)胞是哺乳動物宿主細(xì)胞。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及包含以下核酸序列的分離的多核苷酸所述核酸序列編碼包含SEQ ID NO7的氨基酸序列的多肽。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述多核苷酸還包含編碼異源蛋白的核酸序列。
在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及包含以下核酸序列的重組表達(dá)載體所述核酸序列編碼包含SEQ ID NO7的氨基酸序列的多肽。在具體實(shí)施方案中，所述多核苷酸包含SEQ ID NO5或SEQ ID NO6的核酸序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述多核苷酸選自DNA、cDNA、基因組DNA、RNA、pre-mRNA和反義RNA。在又一個(gè)實(shí)施方案中，所述多核苷酸有效連接一種或多種選自以下的調(diào)節(jié)元件啟動子、增強(qiáng)子、剪接信號、終止信號、核糖體結(jié)合信號和聚腺苷酸化信號。在其它實(shí)施方案中，所述載體DNA選自質(zhì)粒、附加型載體、YAC和病毒載體。
在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及用重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)化或感染的基因工程宿主細(xì)胞，所述重組表達(dá)載體包含以下核酸序列所述核酸序列編碼包含SEQ ID NO7的氨基酸序列的多肽。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述宿主細(xì)胞是哺乳動物宿主細(xì)胞。
在某些其它實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及包含以下核酸序列的分離的多核苷酸所述核酸序列編碼包含SEQ ID NO9的氨基酸序列的多肽。在具體實(shí)施方案中，所述多核苷酸還包含編碼異源蛋白的核酸序列。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及重組表達(dá)載體，所述重組表達(dá)載體包含具有以下核酸序列的多核苷酸所述核酸序列編碼具有SEQ ID NO9的氨基酸序列的多肽。在具體實(shí)施方案中，所述多核苷酸包含SEQ ID NO8的核酸序列。在其它實(shí)施方案中，所述多核苷酸選自DNA、cDNA、基因組DNA、RNA、pre-mRNA和反義RNA。在其它實(shí)施方案中，所述多核苷酸有效連接一種或多種選自以下的調(diào)節(jié)元件啟動子、增強(qiáng)子、剪接信號、終止信號、核糖體結(jié)合信號和聚腺苷酸化信號。在再一個(gè)實(shí)施方案中，所述載體DNA選自質(zhì)粒、附加型載體、YAC和病毒載體。
在一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及用重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)化或感染的基因工程宿主細(xì)胞，所述重組表達(dá)載體包含具有以下核酸序列的多核苷酸所述核酸序列編碼包含SEQ ID NO9的氨基酸序列的多肽。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述宿主細(xì)胞是哺乳動物宿主細(xì)胞。
在又一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及包含以下核酸序列的分離的多核苷酸所述核酸序列編碼包含SEQ ID NO11的氨基酸序列的多肽。在具體實(shí)施方案中，所述多核苷酸還包含編碼異源蛋白的核酸序列。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及重組表達(dá)載體，所述重組表達(dá)載體包含具有以下核酸序列的多核苷酸所述核酸序列編碼具有SEQ ID NO11的氨基酸序列的多肽。在具體實(shí)施方案中，所述多核苷酸包含SEQ ID NO10的核酸序列。在再一個(gè)實(shí)施方案中，所述多核苷酸選自DNA、cDNA、基因組DNA、RNA、pre-mRNA和反義RNA。在又一個(gè)實(shí)施方案中，所述多核苷酸有效連接一種或多種選自以下的調(diào)節(jié)元件啟動子、增強(qiáng)子、剪接信號、終止信號、核糖體結(jié)合信號和聚腺苷酸化信號。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述載體DNA選自質(zhì)粒、附加型載體、YAC和病毒載體。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及用重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)化或感染的基因工程宿主細(xì)胞，所述重組表達(dá)載體包含具有以下核酸序列的多核苷酸所述核酸序列編碼包含SEQ ID NO11的氨基酸序列的多肽。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述宿主細(xì)胞是哺乳動物宿主細(xì)胞。
在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包含SEQ ID NO4的氨基酸序列的分離多肽、包含SEQ ID NO7的氨基酸序列的分離多肽、包含SEQ ID NO9的氨基酸序列的分離多肽以及包含SEQ ID NO11的氨基酸序列的分離多肽。
在某些其它實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包含SEQ ID NO1的核酸序列的分離的多核苷酸或其簡并變異體。在具體實(shí)施方案中，SEQ IDNO1的多核苷酸編碼區(qū)包含核苷酸298到1,653。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及反義RNA分子，所述反義RNA分子與包含SEQ ID NO1的核酸序列的多核苷酸或其簡并變異體反義。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述RNA與以下多核苷酸反義SEQ ID NO1的多核苷酸從約核苷酸1到約核苷酸297，或者SEQ IDNO1的多核苷酸從約核苷酸1,654到約核苷酸3,824。
在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及包含SEQ ID NO2的核酸序列的分離的多核苷酸或其簡并變異體。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，SEQ ID NO2的多核苷酸編碼區(qū)包含核苷酸1到1,313。
在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及反義RNA分子，所述反義RNA分子與包含SEQ ID NO2的核酸序列的多核苷酸或其簡并變異體反義。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述RNA與以下多核苷酸反義SEQ ID NO2的多核苷酸從約核苷酸1,314到約核苷酸3,405。
在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及包含SEQ ID NO3的核酸序列的分離的多核苷酸或其簡并變異體。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，SEQ ID NO3的多核苷酸編碼區(qū)包含核苷酸671到2,026。
在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及反義RNA分子，所述反義RNA分子與包含SEQ ID NO3的核酸序列的多核苷酸或其簡并變異體反義。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述RNA與以下多核苷酸反義SEQ ID NO3的多核苷酸從約核苷酸1到約核苷酸670，或者SEQ IDNO3的多核苷酸從約核苷酸2,027到約核苷酸3,779。
在再一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及包含SEQ ID NO5的核酸序列的分離的多核苷酸或其簡并變異體。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，SEQ ID NO5的多核苷酸編碼區(qū)包含核苷酸684到2,033。
在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及反義RNA分子，所述反義RNA分子與包含SEQ ID NO5的核酸序列的多核苷酸或其簡并變異體反義。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述RNA與以下多核苷酸反義SEQ ID NO5的多核苷酸從約核苷酸1到約核苷酸683，或者SEQ IDNO5的多核苷酸從約核苷酸2,034到約核苷酸3,384。
在又一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及包含SEQ ID NO6的核酸序列的分離的多核苷酸或其簡并變異體。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，SEQ ID NO6的多核苷酸編碼區(qū)包含核苷酸685到2,034。
在其它優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及反義RNA分子，所述反義RNA分子與包含SEQ ID NO6的核酸序列的多核苷酸或其簡并變異體反義。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述RNA與以下多核苷酸反義SEQ ID NO6的多核苷酸從約核苷酸1到約核苷酸684，或者SEQ IDNO6的多核苷酸從約核苷酸2,034到約核苷酸3,384。
在又一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及包含SEQ ID NO8的核酸序列的分離的多核苷酸或其簡并變異體。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，SEQ ID NO8的多核苷酸編碼區(qū)包含核苷酸332到1,858。
在某些優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及反義RNA分子，所述反義RNA分子與包含SEQ ID NO8的核酸序列的多核苷酸或其簡并變異體反義。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述RNA與以下多核苷酸反義SEQ ID NO8的多核苷酸從約核苷酸1到約核苷酸331，或者SEQ IDNO8的多核苷酸從約核苷酸1,859到約核苷酸4,718。
在其它優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及包含SEQ ID NO10的核酸序列的分離的多核苷酸或其簡并變異體。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，SEQID NO10的多核苷酸編碼區(qū)包含核苷酸250到1,785。
在其它優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及反義RNA分子，所述反義RNA分子與包含SEQ ID NO10的核酸序列的多核苷酸或其簡并變異體反義。在某些實(shí)施方案中，所述RNA與以下多核苷酸反義SEQID NO10的多核苷酸從約核苷酸1到約核苷酸249，或者SEQ IDNO10的多核苷酸從約核苷酸1,786到約核苷酸5,386。
在具體的優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及以下多核苷酸包含與SEQ ID NO1或SEQ ID NO1的互補(bǔ)序列在嚴(yán)格性條件下雜交的核酸序列的多核苷酸、包含與SEQ ID NO2或SEQ ID NO2的互補(bǔ)序列在嚴(yán)格性條件下雜交的核酸序列的多核苷酸、包含與SEQ ID NO3或SEQ ID NO3的互補(bǔ)序列在嚴(yán)格性條件下雜交的核酸序列的多核苷酸、包含與SEQ ID NO5或SEQ ID NO5的互補(bǔ)序列在嚴(yán)格性條件下雜交的核酸序列的多核苷酸、包含與SEQ ID NO6或SEQ IDNO6的互補(bǔ)序列在嚴(yán)格性條件下雜交的核酸序列的多核苷酸、包含與SEQ ID NO8或SEQ ID NO8的互補(bǔ)序列在嚴(yán)格性條件下雜交的核酸序列的多核苷酸、或者包含與SEQ ID NO10或SEQ ID NO10的互補(bǔ)序列在嚴(yán)格性條件下雜交的核酸序列的多核苷酸。
在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及與具有SEQ ID NO4、SEQ IDNO7、SEQ ID NO9或SEQ ID NO11的氨基酸序列的蛋白選擇性結(jié)合的抗體。
在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)基因動物，所述轉(zhuǎn)基因動物包含編碼GPCR多肽的多核苷酸，所述GPCR多肽包含選自SEQ IDNO4、SEQ ID NO7、SEQ ID NO9和SEQ ID NO11的氨基酸序列。在具體實(shí)施方案中，所述動物選自小鼠、大鼠、兔和倉鼠。在其它實(shí)施方案中，所述多肽處于可調(diào)節(jié)表達(dá)系統(tǒng)的控制之下。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述多肽包含一個(gè)調(diào)節(jié)GPCR活性的突變。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述動物對所述突變而言為雜合的。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述動物對所述突變而言為純合的。
在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明提供抑制GPCR多核苷酸在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的方法，所述多核苷酸選自SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ IDNO3、SEQ ID NO5、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8和SEQ ID NO10，所述方法包括給所述細(xì)胞提供與所述多核苷酸反義的核酸分子。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及測定試驗(yàn)化合物對GPCR多肽活性的影響的方法，所述方法包括下述步驟提供包含編碼GPCR多肽的多核苷酸的轉(zhuǎn)基因動物，其中所述GPCR多肽具有選自SEQ IDNO4、SEQ ID NO7、SEQ ID NO9和SEQ ID NO11的氨基酸序列；將試驗(yàn)化合物給予所述動物，在存在或不存在所述試驗(yàn)化合物的情況下，測定所述試驗(yàn)化合物對GPCR活性的影響。在具體實(shí)施方案中，所述多核苷酸具有至少一個(gè)選自核苷酸缺失、核苷酸取代和核苷酸插入的突變。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供測定試驗(yàn)化合物對GPCR多肽活性的影響的方法，所述方法包括下述步驟提供包含GPCR多肽的重組細(xì)胞，所述GPCR多肽具有選自SEQ ID NO4、SEQ IDNO7、SEQ ID NO9和SEQ ID NO11的氨基酸序列；使所述細(xì)胞與試驗(yàn)化合物接觸，在存在或不存在所述試驗(yàn)化合物的情況下，測定所述試驗(yàn)化合物對GPCR活性的影響。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，測定所述試驗(yàn)化合物作用選自測量GPCR激酶活性、測量GPCR磷酸化、測量磷脂酰肌醇水平、測量GTP酶活性、測量GTP水平、測量cAMP水平、測量GDP水平和測量Ca2+水平。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述多核苷酸具有至少一個(gè)選自核苷酸缺失、核苷酸取代和核苷酸插入的突變。
在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及治療需要增強(qiáng)GPCR活性的受治療者的方法，所述方法包括給予所述受治療者治療有效量的一種GPCR受體激動劑和/或給予所述受治療者一種編碼GPCR多肽的多核苷酸，所述GPCR多肽包含選自SEQ ID NO4、SEQ ID NO7、SEQID NO9和SEQ ID NO11的氨基酸序列，所述GPCR受體激動劑或編碼GPCR多肽的多核苷酸采用在體內(nèi)產(chǎn)生GPCR活性的形式。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及治療需要抑制GPCR活性的受治療者的方法，所述方法包括給予所述受治療者治療有效量的一種GPCR受體拮抗劑；和/或給予所述受治療者一種抑制編碼GPCR多肽的多核苷酸表達(dá)的多核苷酸，所述GPCR多肽包含選自SEQ IDNO4、SEQ ID NO7、SEQ ID NO9和SEQ ID NO11的氨基酸序列；和/或給予所述受治療者治療有效量的一種與GPCR競爭其配體的多肽。
在又一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供診斷受治療者與GPCR表達(dá)或活性相關(guān)的疾病或?qū)λ黾膊〉囊赘行缘姆椒?，所述方法包括確定編碼GPCR多肽的多核苷酸中是否存在突變，所述GPCR多肽包含選自SEQ ID NO4、SEQ ID NO7、SEQ ID NO9和SEQ ID NO11的氨基酸序列；和/或測定來自所述受治療者的樣品中存在GPCR表達(dá)，其中所表達(dá)的GPCR是編碼GPCR多肽的多核苷酸，所述GPCR多肽包含選自SEQ ID NO4、SEQ ID NO7、SEQ ID NO9和SEQ IDNO11的氨基酸序列。
在再一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供治療需要抑制GPCR活性的受治療者的方法，所述治療包括給予所述患者治療有效量的一種結(jié)合GPCR多肽胞外部分的抗體，所述GPCR多肽包含選自SEQ IDNO4、SEQ ID NO7、SEQ ID NO9和SEQ ID NO11的氨基酸序列。
根據(jù)下面的詳細(xì)描述、其優(yōu)選實(shí)施方案和權(quán)利要求書，本發(fā)明的其它特征和優(yōu)勢將會是顯而易見的。
附圖簡述

圖1顯示人和小鼠UP_11預(yù)測蛋白質(zhì)序列的氨基酸序列比對。
圖2顯示UP_11和OM_10的親水性分布圖。該圖使用Toppred和GES評分系統(tǒng)(Engelman等，1986)產(chǎn)生。顯著性截?cái)嘀?.0以實(shí)線表示。
圖3顯示從基因組預(yù)測和表達(dá)模式獲得的UP_11 GPCR。
圖4顯示從基因組預(yù)測和表達(dá)模式獲得的OM_10 GPCR。
圖5顯示人OM_10 cDNA和基因圖譜。
發(fā)明詳述本發(fā)明鑒定出編碼兩種新型G蛋白偶聯(lián)受體(下文稱為GPCR)的基因。更具體地講，在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及新鑒定的人類基因組多核苷酸，所述多核苷酸編碼命名為UP_11和OM_10的孤獨(dú)GPCR。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及上面鑒定的人類多核苷酸的鼠直向同源物，所述鼠直向同源物編碼命名為mUP_11和mOM_10的孤獨(dú)GPCR。本文定義的孤獨(dú)受體是其天然存在的配體尚未得到鑒定的GPCR多肽。
通過TBLASTN(Altschul等，1997)對GenBank的高通量基因組序列(HTGS)部分和對Celera人類基因組數(shù)據(jù)庫的搜索，鑒定本發(fā)明的孤獨(dú)GPCR。使用人5-HT6受體序列(登錄號L41147)進(jìn)行所述搜索。使用perl script解析上面TBLASTN搜索的結(jié)果，鑒定高分值區(qū)段對蛋白(HSP)序列，然后使用BLASTP算法，用所述序列對全面的蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫進(jìn)行搜索。所述第二次BLAST搜索的命中根據(jù)E(期望)值進(jìn)行排序，根據(jù)與第一個(gè)數(shù)據(jù)庫命中的相似性程度，人工評價(jià)每個(gè)命中的潛在新穎性。這導(dǎo)致鑒定出人類基因組DNA中可能包含新型GPCR的幾個(gè)區(qū)。從數(shù)據(jù)庫中提取基因組DNA的這些區(qū)，使用Genscan算法(Burge和Karlin，1997)預(yù)測每個(gè)可能的新型GPCR的全長基因。使用這些全長基因預(yù)測，設(shè)計(jì)用于分離全長cDNA序列的引物和探針。
預(yù)測命名為OM_10的人GPCR多肽序列(SEQ ID NO9)由一個(gè)外顯子編碼，該外顯子起始于SEQ ID NO8的核苷酸332，終止于核苷酸1,858。與OM_10最接近的數(shù)據(jù)庫同源物是“RE2”，也稱為“人類H2組胺受體”(國際申請第WO 00/06597號、第WO 00/040724號、第WO 98/20040號)，所述同源物包含與SEQ ID NO9氨基酸31到氨基酸220的192個(gè)氨基酸有32％相同以及與SEQ ID NO9氨基酸394到氨基酸468的76個(gè)氨基酸有32％相同的兩個(gè)氨基酸序列段。SEQ ID NO9氨基酸220到氨基酸殘基394的間插氨基酸序列段與IGS1(國際申請第WO 01/09184號)有同源性。預(yù)測該區(qū)編碼所述OM_10多肽的第三個(gè)胞內(nèi)環(huán)，該環(huán)是GPCR超家族成員中最具有可變性的區(qū)域。人OM_10多肽的鼠GPCR直向同源物(SEQ ID NO10)編碼SEQ ID NO11所示的mOM_10多肽。mOM_10多核苷酸的編碼序列包含SEQ ID NO10的核苷酸250到1,785。
命名為UP_11的人GPCR多肽序列(SEQ ID NO4)包含451個(gè)氨基酸殘基，預(yù)測由總共3個(gè)外顯子編碼。SEQ ID NO1的人UP_11cDNA多核苷酸序列(也稱為克隆179)與人受體GPR61有82％序列同一性(Lee等，2000)，具有SEQ ID NO1從核苷酸298到1,653的編碼序列，在核苷酸位置1,920有一個(gè)內(nèi)含子，在核苷酸位置2,879有一個(gè)缺失。由UP_11外顯子2編碼的氨基酸序列與日本申請第合受體蛋白”的232個(gè)氨基酸殘基相同。SEQ ID NO2的人UP_11部分cDNA序列(也命名為克隆200)具有從核苷酸1到1,313的編碼序列，在核苷酸位置1,593有一個(gè)內(nèi)含子。SEQ ID NO3的人UP_11cDNA序列(也命名為克隆30)具有從核苷酸671到2,026的編碼序列，在核苷酸位置70和2,288有一個(gè)內(nèi)含子。
此外，分離包含鼠mUP_11序列的SEQ ID NO5有3,384個(gè)核苷酸的cDNA序列(克隆67.1)以及SEQ ID NO6有3,397個(gè)核苷酸的cDNA序列(克隆52.1)。SEQ ID NO5的核苷酸編碼序列包含核苷酸684到2,033，SEQ ID NO6的核苷酸編碼序列包含核苷酸685到2,034。對mUP_11序列的分析證明，mUP_11包含與人UP_11克隆52.1孤獨(dú)GPCR UP_11有高度氨基酸序列相似性(即94％同一性)的一個(gè)編碼外顯子(圖1)?？寺?2.1孤獨(dú)GPCR UP_11。
UP_11和OM_10的親水性分布圖(圖2)提示存在7個(gè)跨膜(TM)結(jié)構(gòu)域。除所述7個(gè)TM結(jié)構(gòu)域外，所述UP_11和OM_10多肽包含多個(gè)進(jìn)一步提示它們屬于GPCR超家族的特征基序。例如，UP_11和OM_10都在跨膜區(qū)2上包含一個(gè)保守天冬氨酸、前2個(gè)胞外環(huán)中的保守半胱氨酸殘基、與跨膜結(jié)構(gòu)域3相鄰的保守DRY三聯(lián)體(在UP_11中，D被E保守取代)以及許多其它已知對于GPCR結(jié)構(gòu)和功能重要的殘基。對UP_11的表達(dá)分析(圖3)以及對OM_10的表達(dá)分析(圖4)表明，這兩種基因都在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中高水平表達(dá)。當(dāng)通過組織表達(dá)陣列進(jìn)行測定時(shí)，在大腦皮質(zhì)、額葉、頂葉、枕葉、顳葉、大腦皮質(zhì)的旁中央小葉、腦橋、小腦、胼胝體、扁桃體、尾狀核、海馬、延髓、豆?fàn)詈?、黑質(zhì)、accumbens nucleus、丘腦、垂體腺和脊髓中觀察到UP_11表達(dá)。根據(jù)多組織RNA印跡分析，UP_11轉(zhuǎn)錄物主要在腦中檢出，在骨骼肌和心臟中也可以檢出。在RNA印跡上檢測到三種UP_11轉(zhuǎn)錄物，說明所述轉(zhuǎn)錄物可能來自對外顯子的不同使用。在小鼠全腦、嗅球、紋狀體、皮質(zhì)、海馬、丘、中腦和小腦中檢測到mUP_11轉(zhuǎn)錄物。OM_10主要在豆?fàn)詈撕臀矤詈酥斜磉_(dá)。中檢測到mUP_11轉(zhuǎn)錄物。OM_10主要在豆?fàn)詈撕臀矤詈酥斜磉_(dá)。在扁桃體、海馬和髓質(zhì)中也觀察到更弱的表達(dá)。在豆?fàn)詈酥袡z測到兩種OM_10轉(zhuǎn)錄物。在紋狀體、中腦、下丘腦、腦干和丘中檢測到mOM_10轉(zhuǎn)錄物。
因此，在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及編碼GPCR多肽的分離的多核苷酸或其片段，所述分離的多核苷酸包含SEQ ID NO1、SEQID NO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO5、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8或SEQ ID NO10的核酸序列。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及包含SEQ ID NO4、SEQ ID NO7、SEQ ID NO9或SEQ ID NO11的氨基酸序列的GPCR多肽。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及編碼GPCR多肽的多核苷酸，所述GPCR多肽包含SEQ ID NO4、SEQ ID NO7、SEQ ID NO9或SEQ ID NO11的氨基酸序列。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明提供重組載體，所述重組載體包含編碼GPCR多肽的多核苷酸。在另一個(gè)實(shí)施方案中，在宿主細(xì)胞內(nèi)包含載體，其中所述載體包含編碼GPCR多肽的多核苷酸，在所述宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)所述多核苷酸，產(chǎn)生所述編碼多肽或其片段。在其它實(shí)施方案中，提供測定試驗(yàn)化合物調(diào)節(jié)GPCR多肽活性的能力的方法、產(chǎn)生GPCR多肽的方法、診斷受治療者與GPCR表達(dá)或活性有關(guān)的疾病或?qū)λ黾膊〉囊赘行缘姆椒?、以及治療需要抑制或激活GPCR活性的受治療者的方法。
A.編碼UP_11和OM_10 GPCR多肽的分離的多核苷酸考慮將本發(fā)明的分離的純化GPCR多核苷酸用于生產(chǎn)GPCR多肽。因此，一方面，本發(fā)明提供編碼UP_11或OM_10多肽的分離的純化多核苷酸。UP_11多肽定義為包含在SEQ ID NO4中描述的氨基酸序列的多肽(人UP_11)、人UP_11的等位基因變異體以及人UP_11多肽的直向同源物如SEQ ID NO7中描述的氨基酸序列(mUP_11)。OM_10多肽定義為包含SEQ ID NO9中描述的氨基酸序列的多肽(人OM_10)、人OM_10的等位基因變異體以及人OM_10多肽的直向同源物如SEQ ID NO11中描述的氨基酸序列(mOM_10)。
因此，在具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的多核苷酸是DNA分子。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的多核苷酸編碼包含SEQ ID NO4或SEQ ID NO7的氨基酸序列的UP_11多肽、其變異體或其片段。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的多核苷酸編碼包含SEQ ID NO9或SEQ ID NO11的氨基酸序列的OM_10多肽、其變異體或其片段。
在本發(fā)明的另一方面，分離的純化多核苷酸包含選自SEQ IDNO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO5、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8和SEQ ID NO10的核酸序列、其簡并變異體或其互補(bǔ)序列。
優(yōu)選的UP_11多核苷酸包含SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ IDNO3、SEQ ID NO5和SEQ ID NO6中所示的核苷酸序列。SEQ IDNO1、SEQ ID NO2和SEQ ID NO3的序列對應(yīng)于人UP_11 cDNA。這些cDNA包含編碼人UP_11多肽的序列(例如“編碼區(qū)”，SEQ IDNO1從核苷酸298到2,879)以及5′非翻譯序列(SEQ ID NO1核苷酸1到297)和3′非翻譯序列(SEQ ID NO1核苷酸1654到3,824)。SEQ IDNO5和SEQ ID NO6的序列對應(yīng)于編碼人UP_11的鼠直向同源物的cDNA。
優(yōu)選的OM_10多核苷酸包含SEQ ID NO8和SEQ ID NO10中所示的核苷酸序列。SEQ ID NO8的序列對應(yīng)于人OM_10 cDNA。該cDNA包含編碼人OM_10多肽的序列(例如“編碼區(qū)”，SEQ ID NO8從核苷酸332到1858)以及5′非翻譯序列(SEQ ID NO8核苷酸1到331)和3′非翻譯序列(SEQ ID NO8核苷酸1,859到4,718)。SEQ ID NO10的序列對應(yīng)于編碼人OM_10的鼠直向同源物的cDNA。
或者，本發(fā)明的多核苷酸可以僅包含SEQ ID NO1、SEQ IDNO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO5、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8或SEQ ID NO10的編碼區(qū)。
本文所用的術(shù)語“多核苷酸”是指通過磷酸二酯鍵連接的核苷酸序列。在本文中，多核苷酸的方向從5′到3′。本發(fā)明的多核苷酸可以包含約40個(gè)堿基對到約數(shù)百個(gè)堿基對。多核苷酸最好包含約10個(gè)堿基對到約3,000個(gè)堿基對。具體多核苷酸的優(yōu)選長度在下文中敘述。
本發(fā)明的多核苷酸可以是脫氧核糖核酸(DNA)分子、核糖核酸(RNA)分子、或者使用核苷酸類似物產(chǎn)生的DNA或RNA的類似物。核酸分子可以是單鏈或雙鏈，但最好是雙鏈DNA。當(dāng)多核苷酸是DNA分子時(shí)，該分子可以是基因、cDNA分子或基因組DNA分子。本文中用單字母編碼表示核苷酸堿基腺嘌呤(A)、鳥嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)、肌苷(I)和尿嘧啶(U)。
“分離的”是指“經(jīng)由人的勞動”而從自然狀態(tài)改變。假如天然存在“分離的”組合物或物質(zhì)，那么它已經(jīng)被改變，或者離開其原始環(huán)境，或者二者都有。例如，根據(jù)本文所用的術(shù)語，在活動物體內(nèi)天然存在的多核苷酸或多肽不是“分離的”，但與其天然狀態(tài)共存的材料分離的相同多核苷酸或多肽是“分離的”。
“分離的”多核苷酸最好不含獲得所述核酸的生物基因組DNA中天然鄰接所述核酸的序列(即位于所述核酸5′端和3′端的序列)。例如，在各種實(shí)施方案中，分離的GPCR核酸可以包含獲得所述核酸的細(xì)胞(例如神經(jīng)元細(xì)胞或胎盤細(xì)胞)基因組DNA中天然鄰接所述核酸分子的少于約5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb或0.1kb核苷酸序列。然而，所述GPCR核酸分子可以與其它蛋白編碼或調(diào)節(jié)序列融合，而仍然被認(rèn)為是分離的。
可以使用標(biāo)準(zhǔn)克隆和篩選技術(shù)，從由人類細(xì)胞mRNA或基因組DNA產(chǎn)生的cDNA文庫獲得本發(fā)明的多核苷酸。也可以使用眾所周知的商業(yè)化技術(shù)合成本發(fā)明的多核苷酸。
本發(fā)明還包括這樣的核酸分子由于遺傳密碼的簡并性，所述核酸分子與SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQ IDNO5、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8或SEQ ID NO10中所示的核苷酸序列(及其片段)不同，并因此編碼與SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO5、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8或SEQ IDNO10中所示的核苷酸序列所編碼的同樣GPCR多肽。
在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明分離的多核苷酸包含與SEQ IDNO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO5、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8或SEQ ID NO10中所示的核苷酸序列或這些核苷酸序列的片段互補(bǔ)的核酸分子。與SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ IDNO3、SEQ ID NO5、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8或SEQ ID NO10中所示的核苷酸序列互補(bǔ)的核酸分子與SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO5、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8或SEQ IDNO10的核苷酸序列完全互補(bǔ)，以便它能夠與SEQ ID NO1、SEQ IDNO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO5、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8或SEQ ID NO10中所示的核苷酸序列雜交，由此形成穩(wěn)定的雙鏈體。
使用本領(lǐng)域眾所周知的方法，可以容易地鑒定人和鼠UP_11和OM_10多核苷酸的直向同源物和等位基因變異體。這些GPCR的等位基因變異體和直向同源物將包含以下核苷酸序列所述核苷酸序列與SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO5、SEQID NO6、SEQ ID NO8或SEQ ID NO10中所示的核苷酸序列或這些核苷酸序列的片段有一般至少約70-75％同源性、更一般至少約80-85％同源性、最常見至少約90-95％或更高同源性。根據(jù)與SEQ IDNO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO5、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8或SEQ ID NO10中所示的核苷酸序列或這些核苷酸序列的片段(最好在嚴(yán)格性條件下)雜交的能力，可以容易地鑒定所述核酸分子。
此外，本發(fā)明的多核苷酸可以僅包含UP_11或OM_10多核苷酸序列或基因的編碼區(qū)的片段，例如SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO5、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8或SEQ IDNO10的片段。
當(dāng)本發(fā)明的多核苷酸用于重組生產(chǎn)UP_11和OM_10多肽時(shí)，所述多核苷酸可以包括所述成熟多肽的編碼序列本身，或者所述成熟多肽的編碼序列與其它編碼序列在同一可讀框中，所述其它編碼序列例如那些編碼前導(dǎo)序列或分泌序列、前多肽序列、或原多肽序列或前原多肽序列或其它融合肽部分的序列。例如，可以編碼便于純化融合多肽的標(biāo)記序列(參見Gentz等，1989，通過引用結(jié)合到本文中)。所述多核苷酸也可以包含非編碼5′和3′序列，例如轉(zhuǎn)錄但不翻譯的序列、剪接信號和聚腺苷酸化信號、核糖體結(jié)合位點(diǎn)和穩(wěn)定mRNA的序列。
除SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO5、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8或SEQ ID NO10中所示的GPCR核苷酸序列外，本領(lǐng)域技術(shù)人員將會認(rèn)識到，在群體(例如人類群體)內(nèi)可能存在導(dǎo)致UP_11或OM_10多肽的氨基酸序列改變的DNA序列多態(tài)性。由于天然等位基因變異，基因或多核苷酸中的所述遺傳多態(tài)性可能存在于同一群體內(nèi)的不同個(gè)體之間。本文所用的術(shù)語“基因”和“重組基因”是指包含編碼GPCR多肽的可讀框的多核苷酸，所述GPCR多肽最好是哺乳動物UP_11或OM_10多肽。所述天然等位基因變異一般可能導(dǎo)致多核苷酸的核苷酸序列中1-5％的變異。本發(fā)明范圍內(nèi)包括天然等位基因變異引起的UP_11或OM_10多核苷酸內(nèi)任何和所有所述核苷酸變異和由此導(dǎo)致的UP_11或OM_10多核苷酸內(nèi)氨基酸多態(tài)性。所述等位基因變異包括有活性等位基因變異體以及無活性或活性降低的等位基因變異體，后兩種類型一般產(chǎn)生病理疾病。
此外，來自其它物種的編碼UP_11或OM_10多肽的核酸分子和因此具有與SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQ IDNO5、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8或SEQ ID NO10的人或鼠序列不同的核苷酸序列的核酸分子包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。可以如下分離本發(fā)明的對應(yīng)于人UP_11或OM_10 cDNA的天然等位基因變異體和非人類直向同源物的多核苷酸根據(jù)它們與本文公開的人UP_11或OM_10多核苷酸的同源性，依照標(biāo)準(zhǔn)雜交技術(shù)，在嚴(yán)格雜交條件下，用人cDNA或其片段作為雜交探針進(jìn)行分離。
因此，可以通過如下方法從人類以外的物種獲得編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸，包括同源物和直向同源物，所述方法包括下述步驟在嚴(yán)格雜交條件下，用具有SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ IDNO3、SEQ ID NO5、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8或SEQ ID NO10序列或其片段的標(biāo)記探針篩選合適的文庫；然后分離包含所述多核苷酸序列的全長cDNA和基因組克隆。所述雜交技術(shù)是技術(shù)人員熟知的。技術(shù)人員將會認(rèn)識到，在許多情況下，分離的cDNA序列將是不完全的，因?yàn)樗龆嚯牡木幋a區(qū)在所述cDNA的5′末端截短。這是逆轉(zhuǎn)錄酶作用的結(jié)果，所述酶本質(zhì)上具有低“持續(xù)合成能力(processivity)”(酶在聚合反應(yīng)期間保持附著到模板上的能力的度量)，不能在第一條鏈cDNA合成期間完成mRNA模板的DNA拷貝。
因此，在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的多核苷酸序列信息使得可以制備能夠與本文公開的所選多核苷酸的基因序列特異性雜交的相對短的DNA(或RNA)寡核苷酸序列。本文所用的術(shù)語“寡核苷酸”定義為包含兩個(gè)或多個(gè)、通常超過三(3)個(gè)、一般超過十(10)個(gè)直到一百(100)個(gè)(雖然最好在二十個(gè)到三十個(gè)之間)脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的分子。準(zhǔn)確大小取決于許多因素，而這些因素又依賴于所述寡核苷酸的最終功能或應(yīng)用。因此，在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，在考慮所選核苷酸序列的基礎(chǔ)上制備合適長度的核酸探針，所述所選核苷酸序列如SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQID NO5、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8或SEQ ID NO10中所示的序列。所述核酸探針與編碼GPCR的多核苷酸特異性雜交的能力使它們能夠具體地用于多種實(shí)施方案。最重要的是，所述探針可以用于多種測定，以檢測給定樣品中存在互補(bǔ)序列。
在某些實(shí)施方案中，使用寡核苷酸引物是有利的。可以通過任何方法產(chǎn)生這些引物，包括化學(xué)合成、DNA復(fù)制、逆轉(zhuǎn)錄或它們的組合。使用本發(fā)明的多核苷酸設(shè)計(jì)所述引物的序列，以通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)從哺乳動物細(xì)胞檢測、擴(kuò)增或突變編碼GPCR多肽的基因或多核苷酸的特定區(qū)段。
在某些實(shí)施方案中，為檢測雜交體形成，本發(fā)明多核苷酸和合適標(biāo)記結(jié)合使用是有利的。本領(lǐng)域已知各種各樣的合適標(biāo)記，包括能夠給出可檢測信號的放射性配體、酶配體或其它配體，例如抗生物素蛋白/生物素。
與SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO5、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8、SEQ ID NO10包含的核苷酸序列或其片段相同或足夠相同的多核苷酸可以用作cDNA和基因組DNA的雜交探針，或用作核酸擴(kuò)增(PCR)反應(yīng)的引物，以分離編碼本發(fā)明多肽的全長cDNA和基因組克隆，以及用于分離與SEQ ID NO1、SEQ IDNO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO5、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8、SEQ ID NO10或其片段有高度序列相似性的其它基因(包括編碼來自人以外物種的同源物和直向同源物的基因)的分離cDNA和基因組克隆。通常這些核苷酸序列與參比多核苷酸序列的核苷酸序列有至少約70％相同到至少約95％相同。所述探針或引物一般包含至少15個(gè)核苷酸，優(yōu)選包含至少30個(gè)核苷酸，并且可以包含至少50個(gè)核苷酸。尤其優(yōu)選的探針具有30-50個(gè)核苷酸。
有幾種用于獲得全長cDNA或延伸短cDNA的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員可以利用的并且是眾所周知的，例如那些基于cDNA末端快速擴(kuò)增法(RACE)的方法(參見Frohman等，1988)。例如，以MarathonTM技術(shù)(Clontech Laboratories Inc.)為例的技術(shù)最新進(jìn)展已經(jīng)顯著簡化對更長cDNA的搜索。在MarathonTM技術(shù)中，從由所選組織提取的mRNA制備cDNA，并在每一端連接一個(gè)“接頭”序列。然后使用基因特異性寡核苷酸引物和接頭特異性寡核苷酸引物的組合，進(jìn)行核酸擴(kuò)增(PCR)，來擴(kuò)增“丟失”的cDNA 5′端。然后使用“嵌套”引物重復(fù)所述PCR反應(yīng)，“嵌套”引物即設(shè)計(jì)用于在擴(kuò)增產(chǎn)物內(nèi)退火的引物(通常接頭特異性引物的3′端在接頭序列內(nèi)退火，而基因特異性引物的5′端在已知基因序列內(nèi)退火)。然后通過DNA測序和構(gòu)建的全長cDNA分析該反應(yīng)的產(chǎn)物，所述全長cDNA如下構(gòu)建或者通過將所述產(chǎn)物直接連接到現(xiàn)有的cDNA上，產(chǎn)生完整序列，或者使用新序列信息設(shè)計(jì)5′引物，進(jìn)行單獨(dú)的全長PCR。
為提供符合本發(fā)明的某些優(yōu)勢，用于雜交研究或測定的優(yōu)選核酸序列包括與編碼UP_11或OM_10多肽的多核苷酸的至少10個(gè)到大約70個(gè)核苷酸序列段互補(bǔ)的探針分子，所述UP_11或OM_10多肽例如SEQ ID NO4、SEQ ID NO7、SEQ ID NO9或SEQ ID NO11中所示的多肽。大小為長至少10個(gè)核苷酸有助于保證所述片段具有形成既穩(wěn)定又有選擇性的雙鏈體分子的足夠長度。然而，為增加雜交體的穩(wěn)定性和選擇性，一般優(yōu)選在長度大于10個(gè)堿基的序列段內(nèi)有互補(bǔ)序列的分子，由此改善獲得的特異性雜交體分子的質(zhì)量和程度。當(dāng)需要時(shí)，技術(shù)人員一般優(yōu)先設(shè)計(jì)具有25-40個(gè)核苷酸、55-70個(gè)核苷酸或甚至更長的基因互補(bǔ)序列段的核酸分子。可以容易地如下制備所述片段例如，通過化學(xué)方法直接合成所述片段，通過應(yīng)用核酸復(fù)制技術(shù)，例如美國專利第4,683,202號的PCR技術(shù)(通過引用全部結(jié)合到本文中)，或者通過從包含合適插入片段和合適限制酶位點(diǎn)的重組質(zhì)粒切下所選DNA片段。
另一方面，本發(fā)明考慮分離的純化多核苷酸，所述多核苷酸包含與SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO5、SEQID NO6、SEQ ID NO8或SEQ ID NO10的至少10個(gè)連續(xù)堿基的區(qū)段相同或互補(bǔ)的堿基序列，其中所述多核苷酸與編碼UP_11或OM_10多肽的多核苷酸雜交。所述分離的純化多核苷酸最好包含與SEQ IDNO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO5、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8或SEQ ID NO10的至少25到70個(gè)連續(xù)堿基的序列段相同或互補(bǔ)的堿基序列。例如，本發(fā)明的多核苷酸可以包含與所公開的核苷酸序列的40個(gè)或55個(gè)連續(xù)堿基相同或互補(bǔ)的堿基區(qū)段。
因此，由于本發(fā)明的多核苷酸探針分子與所述基因的互補(bǔ)序列段選擇性形成雙鏈體分子的能力，可以使用所述多核苷酸探針分子。根據(jù)所考慮的應(yīng)用，技術(shù)人員將希望使用不同雜交條件，以獲得所述探針對靶序列的不同程度的選擇性。對于需要高程度選擇性的應(yīng)用，技術(shù)人員通常希望使用相對嚴(yán)格的條件來形成雜交體(參見表1)。
當(dāng)然，對于一些應(yīng)用，例如當(dāng)技術(shù)人員希望使用與潛在模板雜交的突變體引物鏈制備突變體時(shí)，或者當(dāng)技術(shù)人員尋求從其它細(xì)胞分離GPCR多肽編碼序列、功能等同物等等時(shí)，一般需要允許形成異源雙鏈體的較不嚴(yán)格的雜交條件。因此，根據(jù)與對照雜交相比的陽性雜交信號，可以容易地鑒定出交叉雜交的種類。無論如何，一般認(rèn)為增加甲酰胺加入量可以使條件更嚴(yán)格，增加甲酰胺加入量與提高溫度的作用方式相同，破環(huán)雜交體雙鏈體的穩(wěn)定性。因此，可以容易地操作雜交條件，由此這也一般成為根據(jù)所希望的結(jié)果而可選的方法。
本發(fā)明也包括能夠在降低的嚴(yán)格性條件下、更優(yōu)選嚴(yán)格性條件下、最優(yōu)選高嚴(yán)格性條件下與本文描述的多核苷酸雜交的多核苷酸。嚴(yán)格性條件的實(shí)例示于下表中高嚴(yán)格性條件是那些至少與例如條件A-F一樣嚴(yán)格性的條件；嚴(yán)格性條件是至少與例如條件G-L一樣嚴(yán)格性的條件；降低的嚴(yán)格性條件是至少與例如條件M-R一樣嚴(yán)格性的條件。
表1嚴(yán)格性條件
(bp)1雜交體長度預(yù)期是雜交多核苷酸的雜交區(qū)。當(dāng)多核苷酸與未知序列的靶多核苷酸雜交時(shí)，雜交體長度假定是所述雜交多核苷酸的長度。當(dāng)已知序列的多核苷酸被雜交時(shí)，則可以通過將所述多核苷酸的所述序列進(jìn)行序列比對并且鑒定出一個(gè)或多個(gè)最適序列互補(bǔ)性的區(qū)域，來確定雜交體長度。
緩沖液H在雜交緩沖液和洗滌緩沖液中，SSPE(1xSSPE為0.15M NaCl、10mMNaH2PO4和1.25mM EDTA，pH7.4)可以替代為SSC(1xSSC為0.15M NaCl和15mM檸檬酸鈉)；在雜交完成之后，將洗滌進(jìn)行15分鐘。
TB-TR預(yù)期長度少于50個(gè)堿基對的雜交體的雜交溫度應(yīng)該是低于雜交體解鏈溫度(Tm)5-10℃，其中Tm按照下列等式來確定。對于長度少于18個(gè)堿基對的雜交體，Tm(℃)＝2(A+T堿基數(shù))*4(G+C堿基數(shù))。對于長度在18-49個(gè)堿基對的雜交體，Tm(℃)＝81.5*16.6(log10Na+)*0.41(％G+C)-(600/N)，其中N為雜交體中的堿基數(shù)，而Na+為雜交緩沖液中鈉離子的濃度(對于1xSSC，Na+＝0.165M)。
對于多核苷酸雜交，嚴(yán)格性條件的其它實(shí)例在以下文獻(xiàn)中提供Sambrook等，1989，Molecular CloningA Laboratory Manual，ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，第9章和第11章，和Ausubel等編著，1995，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，Inc.，第2.10節(jié)和第6.3-6.4節(jié)，所述文獻(xiàn)通過引用全部結(jié)合到本文中。
除上文所述編碼GPCR多肽的核酸分子外，本發(fā)明的另一方面涉及與其反義的分離的核酸分子?！胺戳x”核酸包含與編碼蛋白的“有義”核酸互補(bǔ)的核苷酸序列，如與雙鏈cDNA分子的編碼鏈互補(bǔ)或者與mRNA序列互補(bǔ)。因此，反義核酸可以與有義核酸通過氫鍵結(jié)合。反義核酸可以與完整的GPCR編碼鏈互補(bǔ)，或者僅與其片段互補(bǔ)。在一個(gè)實(shí)施方案中，反義核酸與編碼GPCR多肽的核苷酸序列的編碼鏈的“編碼區(qū)”反義。
術(shù)語“編碼區(qū)”是指包含翻譯成為氨基酸殘基的密碼子的核苷酸序列區(qū)，如SEQ ID NO1的完整編碼區(qū)核苷酸298到1,653、SEQ IDNO2的完整編碼區(qū)核苷酸1到1,313、SEQ ID NO3的完整編碼區(qū)核苷酸671到2,206、SEQ ID NO5的完整編碼區(qū)核苷酸684到2,033、SEQ ID NO6的完整編碼區(qū)核苷酸685到2,034、SEQ ID NO8的完整編碼區(qū)核苷酸332到1,858或SEQ ID NO10的完整編碼區(qū)核苷酸250到1,785。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述反義核酸分子與編碼GPCR多肽的核苷酸序列的編碼鏈的“非編碼區(qū)”反義。術(shù)語“非編碼區(qū)”是指在編碼區(qū)側(cè)翼、不翻譯成為氨基酸的5′和3′序列(即也稱為5′和3′非翻譯區(qū))。例如，SEQ ID NO1的非編碼區(qū)包含核苷酸1到297和核苷酸1,654到3,824、SEQ ID NO2的非編碼區(qū)包含核苷酸1,314到3,456、SEQ ID NO3的非編碼區(qū)包含核苷酸1到670和核苷酸2,027到3,779、SEQ ID NO5的非編碼區(qū)包含核苷酸1到683和核苷酸2,034到3,384、SEQ ID NO6的非編碼區(qū)包含核苷酸1到684和核苷酸2,035到3,384、SEQ ID NO8的非編碼區(qū)包含核苷酸1到331和核苷酸1,859到4,718、SEQ ID NO10的非編碼區(qū)包含核苷酸1到249和核苷酸1,786到5,386。
對于編碼本文公開的GPCR多肽的編碼鏈序列(例如SEQ IDNO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO5、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8或SEQ ID NO10)，可以根據(jù)沃森-克里克堿基配對法則，設(shè)計(jì)本發(fā)明的反義核酸。所述反義核酸分子可以與UP_11或OM_10mRNA的完整編碼區(qū)互補(bǔ)，但更優(yōu)選是僅與UP_11或OM_10mRNA的編碼區(qū)片段或非編碼區(qū)片段反義的寡核苷酸。例如，所述反義寡核苷酸可以與UP_11 mRNA翻譯起始位點(diǎn)周圍的區(qū)互補(bǔ)。
反義寡核苷酸可以長約例如5個(gè)、10個(gè)、15個(gè)、20個(gè)、25個(gè)、30個(gè)、35個(gè)、40個(gè)、45個(gè)或50個(gè)核苷酸?？梢允褂帽绢I(lǐng)域已知的方法，采用化學(xué)合成和酶促連接反應(yīng)，構(gòu)建本發(fā)明的反義多核苷酸。例如，使用設(shè)計(jì)用以增加分子的生物穩(wěn)定性或增加在反義多核苷酸和有義多核苷酸之間形成的雙鏈體的物理穩(wěn)定性的天然存在的核苷酸或各種經(jīng)修飾的核苷酸，可以化學(xué)合成反義多核苷酸(例如反義寡核苷酸)，例如可以使用硫代磷酸酯衍生物和吖啶取代的核苷酸?？捎脕懋a(chǎn)生所述反義多核苷酸的修飾核苷酸的實(shí)例包括5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黃嘌呤、黃嘌呤、4-乙酰胞嘧啶、5-(羧基羥甲基)尿嘧啶、5-羧甲基氨基甲基-2-硫代尿苷、5-羧甲基氨基甲基尿嘧啶、二氫尿嘧啶、β-D-半乳糖基Q核苷(beta-galactosylqueosine)、肌苷、N6-異戊烯基腺嘌呤、1-甲基鳥嘌呤、1-甲基肌苷、2，2-二甲基鳥嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鳥嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-腺嘌呤、7-甲基鳥嘌呤、5-甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、β-D-甘露糖基Q核苷、5′-甲氧基羧甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-N6-異戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-乙醇酸(v)、wybutoxosine、假尿嘧啶、Q核苷、2-硫代胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-乙醇酸甲酯、尿嘧啶-5-乙醇酸(v)、5-甲基-2-硫尿嘧啶、3-(3-氨基-3-N-2-羧丙基)尿嘧啶、(acp3)w和2，6-二氨基嘌呤。
另一方面，可以用以反義方向(即從插入多核苷酸轉(zhuǎn)錄的RNA對于目標(biāo)靶多核苷酸而言必定為反義方向，在下面的小節(jié)中有進(jìn)一步的描述)，將核酸亞克隆到表達(dá)載體中，通過生物學(xué)方法產(chǎn)生反義核酸。
本發(fā)明的反義核酸分子通常原位給予受治療者，或者在受治療者體內(nèi)原位產(chǎn)生，以便它們與編碼UP_11或OM_10多肽的細(xì)胞mRNA和/或基因組DNA雜交或結(jié)合，因此通過例如抑制轉(zhuǎn)錄和/或翻譯而抑制所述多肽的表達(dá)。所述雜交可以通過常規(guī)核苷酸互補(bǔ)性形成穩(wěn)定的雙鏈體，或者例如在結(jié)合DNA雙鏈體的反義核酸分子的情況下，通過雙螺旋大溝內(nèi)的特異性相互作用。本發(fā)明反義核酸分子給予途徑的實(shí)例包括在組織位點(diǎn)直接注射?；蛘?，可以修飾反義核酸分子使其靶向所選細(xì)胞，然后系統(tǒng)給予。例如，對于系統(tǒng)給予，可以修飾反義分子，使其特異性結(jié)合在所選細(xì)胞表面表達(dá)的受體或抗原，例如通過將所述反義核酸分子連接到結(jié)合細(xì)胞表面受體或抗原的肽或抗體。然后可以使用本文所述載體，將所述反義核酸分子傳遞到細(xì)胞。
在又一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的反義核酸分子是α-端基異構(gòu)核酸分子。α-端基異構(gòu)核酸分子與互補(bǔ)RNA形成特殊的雙鏈雜交體，其中與通常的γ-單位相反，所述鏈相互平行(Gaultier等(1987))。所述反義多核苷酸分子也可以包含一個(gè)2′-鄰甲基核糖核苷酸(Inoue等，1987(a))或嵌合RNA-DNA類似物(Inoue等，1987(b))。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的反義核酸是核酶。核酶是具有核糖核酸酶活性的催化性RNA分子，能夠切割與它們有互補(bǔ)區(qū)的單鏈核酸例如mRNA。因此，可以使用核酶(例如錘頭型核酶(在Haselhoff和Gerlach，1988中描述))催化性切割GPCR mRNA轉(zhuǎn)錄物，由此抑制GPCR mRNA的翻譯?？梢愿鶕?jù)本文公開的GPCR cDNA的核苷酸序列(例如SEQ ID NO1)，設(shè)計(jì)對GPCR編碼核酸有特異性的核酶。例如，可以構(gòu)建四膜蟲屬(Tetrahymena)L-19 IVS RNA的衍生物，其中活性位點(diǎn)的核苷酸序列與GPCR編碼mRNA中要切割的核苷酸序列互補(bǔ)。參見例如Cech等的美國專利第4,987,071號和Cech等的美國專利第5,116,742號，所述兩個(gè)專利通過引用全部結(jié)合到本文中?；蛘?，可以使用GPCR mRNA，從RNA分子庫選擇具有特異性核糖核酸酶活性的催化性RNA。參見例如Bartel和Szostak，1993。
或者，可以通過指導(dǎo)與UP_11或OM_10基因調(diào)節(jié)區(qū)(例如基因啟動子和/或增強(qiáng)子)互補(bǔ)的核苷酸序列形成三螺旋結(jié)構(gòu)，預(yù)防所述基因在靶細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄，從而抑制基因表達(dá)。一般參見Helene，1991；Helene等，1992；和Maher，1992)。
也可以采用RNA干涉(RNAi)來抑制GPCR基因表達(dá)。這是一項(xiàng)針對轉(zhuǎn)錄后基因沉默(PTGS)的技術(shù)，其中靶基因活性被關(guān)連雙鏈RNA(dsRNA)特異性消除。RNAi在許多方面類似于植物中的PTGS并且已在許多無脊椎動物中檢測到，所述無脊椎動物包括錐蟲、水螅、渦蟲、線蟲和果蠅(黑腹果蠅(Drosophila melanogaster))。它可以參與調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)座元件固定化和抗病毒狀態(tài)形成。哺乳動物系統(tǒng)中的RNAi公開于國際申請第WO 00/63364號，所述申請通過引用全部結(jié)合到本文中?；旧?，將與靶(GPCR)同源的至少約600個(gè)核苷酸大小的dsRNA導(dǎo)入細(xì)胞，然后觀察基因活性的序列特異性降低。
B.分離的UP_11和OM_10多肽在具體實(shí)施方案中，本發(fā)明提供分離的純化UP_11和OM_10GPCR多肽。本發(fā)明的GPCR多肽最好是重組多肽。通常，在非人類細(xì)胞中通過重組表達(dá)產(chǎn)生GPCR。
依照本發(fā)明的UP_11多肽包括包含以下的多肽1)SEQ ID NO4或SEQ ID NO7中所示的氨基酸序列；2)人UP_11多肽的功能性和非功能性天然存在的等位基因變異體；3)重組產(chǎn)生的人UP_11多肽的變異體；和4)從除人類以外的生物分離的UP_11多肽(人UP_11多肽的直向同源物)。
依照本發(fā)明的OM_10多肽包括包含以下的多肽1)SEQ ID NO9或SEQ ID NO11中所示的氨基酸序列；2)人OM_10多肽的功能性和非功能性天然存在的等位基因變異體；3)重組產(chǎn)生的人OM_10多肽的變異體；和4)從除人類以外的生物分離的OM_10多肽(人OM_10多肽的直向同源物)。
依照本發(fā)明的人UP_11多肽的等位基因變異體包括1)從人類細(xì)胞或組織分離的多肽；2)與編碼人UP_11多肽的遺傳位點(diǎn)相同的遺傳位點(diǎn)編碼的多肽；和3)包含與人UP_11有實(shí)質(zhì)同源性的多肽。同樣，依照本發(fā)明的人OM_10多肽的等位基因變異體包括1)從人類細(xì)胞或組織分離的多肽；2)與編碼人OM_10多肽的遺傳位點(diǎn)相同的遺傳位點(diǎn)編碼的多肽；和3)包含與人OM_10有實(shí)質(zhì)同源性的多肽。
人UP_11和OM_10的等位基因變異體包括功能性和非功能性UP_11和OM_10多肽。功能性等位基因變異體是保持結(jié)合UP_11配體或OM_10配體以及在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)信號的能力的人UP_11或OM_10多肽的天然存在的氨基酸序列變異體。功能性等位基因變異體通常僅包含SEQ ID NO4、SEQ ID NO7、SEQ ID NO9或SEQ ID NO11一個(gè)或多個(gè)氨基酸的保守取代，或者所述多肽非關(guān)鍵區(qū)內(nèi)非關(guān)鍵殘基的取代、缺失或插入。
非功能性等位基因變異體是沒有結(jié)合配體和/或在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)信號的能力的人UP_11或OM_10多肽的天然存在的氨基酸序列變異體。非功能性等位基因變異體通常包含SEQ ID NO4、SEQ ID NO7、SEQ ID NO9或SEQ ID NO11的氨基酸序列非保守取代、缺失或插入，或者所述序列的成熟前截短，或者在關(guān)鍵殘基或關(guān)鍵區(qū)的取代、缺失或插入。
本發(fā)明還提供人UP_11或OM_10多肽的非人類直向同源物。人UP_11或OM_10多肽的直向同源物是從非人類生物中分離并具有與人GPCR多肽相同的配體結(jié)合和信號傳遞能力的多肽?？梢匀菀椎罔b定如下多肽為人UP_11或OM_10多肽的直向同源物所述多肽包含與SEQ ID NO4、SEQ ID NO7、SEQ ID NO9或SEQ ID NO11實(shí)質(zhì)同源的氨基酸序列。
在本文中，當(dāng)兩種蛋白(或所述蛋白的一個(gè)區(qū))的氨基酸序列相互之間有至少約60-65％同源性、通常至少約70-75％同源性、更通常至少約80-85％同源性、最通常至少約90-95％或更高同源性時(shí)，則所述兩種蛋白在實(shí)質(zhì)上同源。為確定兩種氨基酸序列(例如SEQ ID NO4和其等位基因變異體)或兩種核酸之間的同源性百分率，為最佳比較的目的比對所述序列(例如可以在進(jìn)行最佳比對的一種蛋白質(zhì)序列或核酸序列與另一種蛋白質(zhì)序列或核酸序列中引入空位(gap))。然后比較在相應(yīng)氨基酸位置或核苷酸位置上的氨基酸殘基或核苷酸。當(dāng)一種序列(例如SEQ ID NO4)上一個(gè)位置被另一個(gè)序列(例如人UP_11蛋白的等位基因變異體)上相應(yīng)位置同樣的氨基酸殘基或核苷酸占據(jù)時(shí)，那么所述分子在該位置同源(即本文所用的氨基酸或核酸“同源性”等同于氨基酸或核酸“同一性”)。兩種序列之間的同源性百分率是所述序列共享的相同位置數(shù)的函數(shù)(即同源性％＝相同位置數(shù)/總位置數(shù)×100)。
關(guān)于序列比較，通常將一個(gè)序列作為參比序列，將待測序列與其進(jìn)行比較。當(dāng)使用序列比較算法時(shí)，將待測序列和參比序列輸入計(jì)算機(jī)，必要時(shí)指定亞序列坐標(biāo)，并且指定序列算法程序參數(shù)。根據(jù)所述指定程序參數(shù)，序列比較算法則計(jì)算待測序列相對于參比序列的序列同一性百分率。
可以使用如下算法進(jìn)行為比較目的的最佳序列比對例如Smith和Waterman，1981的局部同源性算法、Needleman和Wunsch，1970的同源性比對算法、Pearson和Lipman相似性搜索方法、這些算法的計(jì)算機(jī)化工具(在Wisconsin Genetics Software Package，GeneticsComputer Group，575 Science Dr.，Madison，WI中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA)，或者目測檢查(一般參見Ausubel等，John Wiley& Sons；1992)。
有用算法的一個(gè)實(shí)例是PILEUP。PILEUP運(yùn)用漸近配對序列比對，由一組相關(guān)序列創(chuàng)建多組序列比對，以顯示相關(guān)性和序列同一性百分率。它也繪出進(jìn)化樹或分枝圖(dendogram)，以顯示用來創(chuàng)建所述序列比對的聚類關(guān)系。PILEUP采用Feng和Doolittle，1987的漸近序列比對方法的簡化方法。所使用的方法類似于Higgins和Sharp，1989描述的方法。所述程序可以比對多達(dá)300個(gè)序列，每個(gè)序列最大長度為5,000個(gè)核苷酸或氨基酸。所述多序列比對法始于兩個(gè)最為相似序列的配對比對，產(chǎn)生一組兩個(gè)經(jīng)比對的序列。然后該組序列與下一個(gè)最相關(guān)的序列或下一組經(jīng)比對的序列進(jìn)行比對。通過兩個(gè)個(gè)別序列的配對比對的簡單延伸，將兩組序列進(jìn)行比對。通過一系列漸近配對序列比對，完成最終的序列比對。通過指定具體序列及其序列比較區(qū)的氨基酸或核苷酸坐標(biāo)并且指定程序參數(shù)，運(yùn)行該程序。例如，采用以下參數(shù)缺省空位加權(quán)(default gap weight)(3.00)、缺省空位長度加權(quán)(default gap length weight)(0.10)和加權(quán)末端空位(weighted end gap)，可以將參比序列與其它待測序列進(jìn)行比較，以確定序列同一性關(guān)系百分率。
適用于測定序列同一性百分率和序列相似性百分率的算法的另一個(gè)實(shí)例是BLAST算法，該算法在Altschul等，1990中有描述。用于進(jìn)行BLAST分析的軟件公眾可通過the National Center forBiotechnology Information得到。該算法包括首先通過鑒定在查詢序列中與數(shù)據(jù)庫序列中相同長度的字串比對時(shí)或者匹配或者滿足某些正數(shù)值最低分值T的長度W的短字串，來鑒定高分序列配對(HSP)。T被稱為鄰近字串最低分值。這些原始鄰近字串命中作為起始搜索以發(fā)現(xiàn)含有它們的更長HSP的種子。只要累積序列比對分值可以增加，字串命中則以兩個(gè)方向沿每個(gè)序列延伸。
字串命中在每個(gè)方向的延伸當(dāng)遇到下述情況之一時(shí)終止累積序列比對分值比其獲得的最大值低數(shù)量X；累積分值為零或零以下，這是由于一個(gè)或多個(gè)負(fù)打分殘基比對的累積所致；或者到達(dá)任一序列的末端。BLAST算法參數(shù)W、T和X決定所述比對的靈敏度和速度。BLAST程序使用的缺省字長(wordlength)(W)為11，BLOSUM62打分矩陣(參見Henikoff和Henikoff，1989)序列比對(B)為50，期望值(E)為10，M＝5，N＝-4，并且比較兩條鏈。
BLAST算法除計(jì)算序列同一性百分率外，也進(jìn)行兩個(gè)序列之間相似性的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析(參見例如Karlin和Altschul，1993)。BLAST算法提供的一種相似性測定是最小和概率(P(N))，它提供兩個(gè)核苷酸序列或氨基酸序列可能偶然發(fā)生匹配的概率的指標(biāo)。例如，如果待測核酸與參比核酸比較中的最小和概率低于0.1，更優(yōu)選低于大約0.01，最優(yōu)選小于約0.001，則認(rèn)為待測核酸與參比序列相似。
可以在本發(fā)明多肽的結(jié)構(gòu)中進(jìn)行修飾和改變，而仍獲得具有UP_11樣或OM_10樣受體特征的分子。例如，可以用其它氨基酸取代序列中的某些氨基酸，而不明顯損失受體活性。因?yàn)槎嚯牡慕换プ饔媚芰捅举|(zhì)定義多肽的生物學(xué)功能活性，所以可以在多肽序列中(當(dāng)然，或者在其可能的DNA編碼序列中)進(jìn)行某些氨基酸序列取代，而仍然獲得有相似性質(zhì)的多肽。
當(dāng)進(jìn)行所述改變時(shí)，可以考慮氨基酸的親水指數(shù)。氨基酸親水指數(shù)對于賦予多肽交互生物學(xué)功能的重要性是本領(lǐng)域眾所周知的(Kyte & Doolittle，1982)。已知某些氨基酸可以被其它具有相似親水指數(shù)或分值的氨基酸取代，而仍然產(chǎn)生有相似生物活性的多肽。在疏水性和電荷特征的基礎(chǔ)上，為每種氨基酸都指定親水指數(shù)。這些指數(shù)是異亮氨酸(+4.5)；纈氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)；甲硫氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；蘇氨酸(-0.7)；絲氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；組氨酸(-3.2)；谷氨酸(-3.5)；谷氨酰胺(-3.5)；天冬氨酸(-3.5)；天冬酰胺(-3.5)；賴氨酸(-3.9)；和精氨酸(-4.5)。
相信氨基酸殘基的相對親水特征決定所得多肽的二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)，而多肽的二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)又決定所述多肽與其它分子(例如酶、底物、受體、抗體、抗原等)的相互作用。本領(lǐng)域已知一種氨基酸可以被另一種具有相似親水指數(shù)的氨基酸取代，而仍獲得在功能上等同的多肽。在這樣的改變中，優(yōu)選親水指數(shù)在+/-2以內(nèi)的氨基酸的取代，尤其優(yōu)選親水指數(shù)在+/-1的氨基酸的取代，甚至更優(yōu)選親水指數(shù)在+/-0.5以內(nèi)的氨基酸的取代。
也可以在親水性的基礎(chǔ)上進(jìn)行相似氨基酸的取代，尤其是在由此產(chǎn)生的生物學(xué)功能等同多肽或肽用于免疫學(xué)實(shí)施方案的情況下。美國專利第4,554,101號陳述由相鄰氨基酸的親水性決定的多肽的最大局部平均親水性與其免疫原性和抗原性相關(guān)，即與所述多肽的生物學(xué)性質(zhì)相關(guān)，該專利通過引用全部結(jié)合到本文中。
如在美國專利第4,554,101號中詳細(xì)敘述的，為氨基酸殘基指定以下親水性值精氨酸(+3.0)；賴氨酸(+3.0)；天冬氨酸(+3.0±1)；谷氨酸(+3.0±1)；絲氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；脯氨酸(-0.5±1)；蘇氨酸(-0.4)；丙氨酸(-0.5)；組氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；甲硫氨酸(-1.3)；纈氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；異亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)；色氨酸(-3.4)。已知一種氨基酸可以被另一種具有相似親水性值的氨基酸取代而仍然獲得在生物學(xué)上等同、尤其是在免疫學(xué)上等同的多肽。在所述改變中，優(yōu)選親水性值在±2內(nèi)的氨基酸的取代，尤其優(yōu)選親水性值在±1內(nèi)的取代，甚至更優(yōu)選親水性值在±0.5內(nèi)的氨基酸的取代。
因此，如上文所概述的，氨基酸取代一般基于氨基酸側(cè)鏈取代基的相對相似性，例如它們的疏水性、親水性、電荷、大小等。考慮上述各種特征的示例性取代是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的，包括精氨酸和賴氨酸；谷氨酸和天冬氨酸；絲氨酸和蘇氨酸；谷氨酰胺和天冬酰胺；以及纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸(參見表2)。因此，本發(fā)明考慮如上所述的GPCR多肽的功能等同物或生物學(xué)等同物。
表2原始?xì)埢纠匀〈臍埢?
也可以使用定點(diǎn)誘變制備多肽的生物學(xué)等同物或功能等同物。定點(diǎn)誘變是通過對可能DNA的特異性誘變，從多肽序列制備第二代多肽或在生物學(xué)上等同的多肽或肽的技術(shù)。如上所述，當(dāng)需要進(jìn)行氨基酸取代時(shí)，可能希望有所述改變。該技術(shù)進(jìn)一步提供容易地制備和測試序列變異體的能力，例如通過在DNA中引入一個(gè)或多個(gè)核苷酸序列改變而加入一種或多種上文考慮的改變。定點(diǎn)誘變允許通過使用編碼所需突變DNA序列的特異性寡核苷酸序列以及足夠數(shù)量的相鄰核苷酸而產(chǎn)生突變體，提供具有足夠大小和序列復(fù)雜性以在所跨越的缺失連接兩端形成穩(wěn)定雙鏈體的引物序列。通常，優(yōu)選長度約17-25個(gè)核苷酸的引物，在需要改變的序列的連接兩側(cè)各有約5-10個(gè)殘基。
一般而言，定點(diǎn)誘變技術(shù)是本領(lǐng)域眾所周知的。正如技術(shù)人員將會認(rèn)識到的，該技術(shù)一般使用以單鏈形式和雙鏈形式都可以存在的噬菌體載體。通常，如下進(jìn)行依照本文的定點(diǎn)誘變首先獲得單鏈載體，所述單鏈載體在其序列內(nèi)包括編碼所有或部分所選的GPCR多肽序列的DNA序列。制備(例如合成)帶有所需突變序列的寡核苷酸引物。然后使該引物退火到所述單鏈載體，使用酶如大腸桿菌(E.coli)聚合酶I克列諾片段延伸，以完成攜帶突變的鏈的合成。因此，形成異源雙鏈體，其中一條鏈編碼原始的無突變序列，而第二條鏈帶有所需突變。然后用該異源雙鏈體載體轉(zhuǎn)化合適的細(xì)胞，例如大腸桿菌細(xì)胞，然后選擇包括攜帶所述突變的重組載體的克隆。市售的試劑盒提供除寡核苷酸引物以外的所有所需試劑。
UP_11 GPCR多肽和OM_10 GPCR多肽是參與細(xì)胞內(nèi)信號途徑的GPCR。本文所用的信號途徑是指當(dāng)配體與GPCR多肽結(jié)合時(shí)，調(diào)節(jié)(例如刺激或抑制)細(xì)胞功能/活性。所述功能的實(shí)例包括動員參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的細(xì)胞內(nèi)分子，如磷脂酰肌醇4，5-二磷酸(PIP2)、肌醇1，4，5-三磷酸(IP3)或腺苷酸環(huán)化酶；極化質(zhì)膜；產(chǎn)生或分泌分子；改變細(xì)胞組分的結(jié)構(gòu)；細(xì)胞增殖，如合成DNA；細(xì)胞遷移；細(xì)胞分化；和細(xì)胞存活。
根據(jù)細(xì)胞類型，GPCR多肽/配體結(jié)合所介導(dǎo)的反應(yīng)可以不同。例如，在一些細(xì)胞中，配體結(jié)合GPCR多肽可能通過磷脂酰肌醇或環(huán)狀A(yù)MP代謝和更新而刺激附著、遷移、分化等活性，而在其它細(xì)胞中，配體結(jié)合GPCR多肽將產(chǎn)生不同結(jié)果。不論由GPCR調(diào)節(jié)的細(xì)胞活性如何，普遍的情況是，GPCR多肽是GPCR并且與“G多肽”相互作用，在細(xì)胞內(nèi)例如通過磷脂酰肌醇或環(huán)狀A(yù)MP代謝和更新在多種細(xì)胞內(nèi)信號途徑中產(chǎn)生一種或多種第二信號。G多肽代表一個(gè)異三聚體多肽家族，所述異三聚體多肽由α、β和γ亞基組成，并且結(jié)合鳥嘌呤核苷酸。這些多肽通常連接細(xì)胞表面受體，如包含七個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域的受體，例如配體受體。當(dāng)配體結(jié)合受體后，構(gòu)象變化傳遞到G多肽，導(dǎo)致α亞基交換結(jié)合的GDP分子成為GTP分子，并與N亞基解離。α亞基的GTP結(jié)合形式通常作為效應(yīng)物調(diào)節(jié)部分起作用，導(dǎo)致產(chǎn)生第二信使，例如環(huán)狀A(yù)MP(例如通過激活腺苷酸環(huán)化酶)、二酰甘油或肌醇磷酸。已知人體中有多于20種不同類型的α亞基，與種類較少的β亞基和γ亞基結(jié)合。
本文所用的“磷酯酰肌醇更新和代謝”是指涉及磷酯酰肌醇4，5-二磷酸(PIP2)更新和代謝的分子以及這些分子的活性。PIP2是一種存在于質(zhì)膜胞質(zhì)小葉中的磷脂。在一些細(xì)胞中，配體結(jié)合GPCR激活質(zhì)膜上的磷脂酶C，所述磷脂酶C可以水解PIP2，產(chǎn)生1，2-二酰甘油(DAG)和肌醇1，4，5-三磷酸(IP3)。一旦形成的IP3擴(kuò)散到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)表面，它就可以結(jié)合IP3受體，例如包含IP3結(jié)合位點(diǎn)的鈣通道多肽。IP3結(jié)合能夠誘導(dǎo)開啟所述通道，允許鈣離子釋放到胞質(zhì)中。IP3也可以被特異性激酶磷酸化，形成肌醇1，3，4，5-四磷酸，肌醇1，3，4，5-四磷酸是一種使鈣從胞外基質(zhì)進(jìn)入胞質(zhì)的分子。然后IP3和肌醇1，3，4，5-四磷酸可能分別被快速水解成無活性產(chǎn)物肌醇1，4-二磷酸和肌醇1，3，4-三磷酸。細(xì)胞可以重新利用這些無活性產(chǎn)物合成PIP2。水解PIP2產(chǎn)生的另一種第二信使是1，2-二酰甘油(DAG)，該分子留在細(xì)胞膜內(nèi)，可用來激活多肽激酶C。多肽激酶C一般在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)是可溶的，但當(dāng)細(xì)胞內(nèi)鈣濃度增加時(shí)，該酶可移動到質(zhì)膜上，可被DAG激活。不同細(xì)胞中多肽激酶C的激活導(dǎo)致不同的細(xì)胞反應(yīng)，例如糖原合成酶的磷酸化，或者各種轉(zhuǎn)錄因子如NF-kB的磷酸化。本文所用的術(shù)語“磷酯酰肌醇活性”指PIP2或其一種代謝物的活性。
GPCR多肽可能參與的另一種信號途徑是cAMP更新途徑。本文所用的“環(huán)狀A(yù)MP更新和代謝”是指涉及環(huán)狀A(yù)MP(cAMP)更新和代謝的分子以及這些分子的活性。環(huán)狀A(yù)MP是響應(yīng)配體誘導(dǎo)的某些G多肽偶聯(lián)受體刺激而產(chǎn)生的一種第二信使。在配體信號途徑中，配體與配體受體結(jié)合可能導(dǎo)致激活腺苷酸環(huán)化酶，而腺苷酸環(huán)化酶催化cAMP的合成。新合成的cAMP可能又激活依賴于cAMP的多肽激酶。這種活化激酶可能例如使電壓門控鉀通道多肽或者與其結(jié)合多肽磷酸化，導(dǎo)致所述鉀通道在動作電位期間不能打開。所述鉀通道不能打開導(dǎo)致鉀離子外流減少，這通常使神經(jīng)元的膜復(fù)極化，導(dǎo)致膜去極化延長。當(dāng)然，所述活化cAMP激酶也可以影響其它分子，例如酶(例如代謝酶)、轉(zhuǎn)錄因子、腺苷酸環(huán)化酶等。
本發(fā)明的UP_11或OM_10受體多肽是包含與UP_11或OM_10多肽有基本序列相似性、結(jié)構(gòu)相似性和/或功能相似性的任何GPCR多肽，其中所述UP_11或OM_10多肽包含選自SEQ ID NO4、SEQ IDNO7、SEQ ID NO9和SEQ ID NO11的氨基酸序列。此外，本發(fā)明的UP_11或OM_10多肽不限于特定來源。因此，本發(fā)明提供從多種來源一般性檢測和分離UP_11或OM_10受體多肽的種類。例如，事實(shí)上GPCR多肽存在于所有哺乳動物(包括人)中。GP57受體和GP58受體的序列以前已有描述(Lee等，2000；歐洲申請?zhí)朎P 0859055)。同其它受體的情況一樣，有可能不同物種的GPCR受體結(jié)構(gòu)和功能之間的差異很小。當(dāng)物種間存在差異時(shí)，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠鑒定出這些差異。因此，本發(fā)明考慮來自任何哺乳動物的UP_11或OM_10多肽，其中優(yōu)選的哺乳動物是人。
本發(fā)明還提供UP_11或OM_10多肽的片段。本文所用的片段包括來自UP_11或OM_10的至少8個(gè)連續(xù)氨基酸。在本發(fā)明中，考慮可能最好將UP_11或OM_10多肽切割成為片段，進(jìn)一步用于結(jié)構(gòu)分析或功能分析，或者用于產(chǎn)生試劑，例如UP_11或OM_10相關(guān)多肽和UP_11、OM_10特異性抗體。這可以通過用肽酶處理純化或未純化的UP_11或OM_10而完成，所述肽酶例如內(nèi)切多肽酶glu-C(Boehringer，Indianapolis，IN)。用CNBr處理是另一種方法，由此可以從天然UP_11或OM_10產(chǎn)生UP_11或OM_10片段。也可以使用重組技術(shù)產(chǎn)生UP_11或OM_10的特定片段。
優(yōu)選的片段是具有UP_11或OM_10多肽一種或多種生物活性(例如結(jié)合G蛋白的能力)的片段以及能夠用作免疫原產(chǎn)生抗UP_11或抗OM_10抗體的片段。UP_11或OM_10多肽的生物活性片段包括由UP_11或OM_10多肽的氨基酸序列衍生的氨基酸序列的肽，并且表現(xiàn)UP_11或OM_10多肽的至少一種活性，所述UP_11或OM_10多肽的氨基酸序列例如SEQ ID NO4、SEQ ID NO7、SEQ ID NO9、SEQID NO11中所示的氨基酸序列或與UP_11或OM_10多肽同源的多肽的氨基酸序列，所述與UP_11或OM_10多肽同源的多肽包括比全長UP_11或OM_10多肽或者與UP_11或OM_10多肽同源的全長多肽更少的氨基酸。通常，生物活性片段(肽，如長5個(gè)、10個(gè)、15個(gè)、20個(gè)、30個(gè)、35個(gè)、36個(gè)、37個(gè)、38個(gè)、39個(gè)、40個(gè)、50個(gè)、100個(gè)或更多氨基酸的肽)包含結(jié)構(gòu)域或基序，如跨膜結(jié)構(gòu)域或G蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域。
另外，本發(fā)明還考慮了配制與UP_11或OM_10立體相似的化合物，以模擬所述肽結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵部分，所述化合物稱為肽模擬物(peptidomimetics)。模擬物(mimitic)是模擬多肽二級結(jié)構(gòu)元件的含肽分子。參見例如Johnson等(1993)。應(yīng)用肽模擬物背后的基本原理是多肽的肽骨架主要用于確定氨基酸側(cè)鏈的方向，以便以這樣的方式促進(jìn)分子間相互作用，例如受體和配體間的相互作用。
目前肽模擬物概念的成功應(yīng)用集中在多肽內(nèi)β-轉(zhuǎn)角的模擬物。同樣，通過上文討論的基于計(jì)算機(jī)的算法，可以預(yù)測UP_11或OM_10內(nèi)的β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)。一旦確定所述轉(zhuǎn)角的組成氨基酸，就可以構(gòu)建模擬物，獲得氨基酸側(cè)鏈必需元件的相似空間取向。
可以從天然表達(dá)UP_11或OM_10多肽的細(xì)胞純化分離的所述多肽，或者從經(jīng)改變以表達(dá)UP_11或OM_10多肽的細(xì)胞純化所述多肽，或者使用已知的蛋白質(zhì)合成方法合成所述多肽。如下所述，最好通過重組DNA技術(shù)產(chǎn)生分離的UP_11或OM_10多肽。例如，將編碼所述蛋白的核酸分子克隆到表達(dá)載體中，然后將所述表達(dá)載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞中，并在所述宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)所述UP_11或OM_10多肽。然后使用標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)純化技術(shù)，根據(jù)合適的純化方案，從所述細(xì)胞中分離出UP_11或OM_10多肽。作為重組表達(dá)的另一種方法，可以使用標(biāo)準(zhǔn)肽合成技術(shù)，化學(xué)合成UP_11或OM_10多肽或片段。最后，可以從天然表達(dá)UP_11或OM_10多肽的細(xì)胞(例如尾狀核、豆?fàn)詈?分離出天然UP_11或OM_10多肽。
本發(fā)明還提供UP_11或OM_10嵌合蛋白或融合蛋白。本文所用的UP_11或OM_10多肽“嵌合蛋白”或“融合蛋白”包含與非UP_11多肽或非OM_10多肽有效連接的UP_11或OM_10多肽?！癠P_11或OM_10多肽”是指具有對應(yīng)于UP_11或OM_10多肽的氨基酸序列的多肽，而“非UP_11多肽或非OM_10多肽”是指具有對應(yīng)于與UP_11或OM_10多肽基本不同源的多肽的氨基酸序列的異源多肽，例如與UP_11或OM_10多肽不同的蛋白。在融合蛋白的范圍內(nèi)，術(shù)語“有效連接”是指所述UP_11或OM_10多肽以及所述非UP_11多肽或非OM_10多肽相互符合讀框地融合。所述非UP_11多肽或非OM_10多肽可以與所述UP_11或OM_10多肽的N末端或C末端融合。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，所述融合多肽是GST-UP_11或OM_10融合多肽，其中UP_11序列或OM_10序列與GST序列的C末端融合。融合多肽的其它類型包括但不限于酶促融合蛋白，例如β-半乳糖苷酶融合物、酵母雙雜種GAL融合物、聚His融合物和Ig融合物。
所述融合多肽，尤其是聚His融合物，可能促進(jìn)重組UP_11或OM_10多肽的純化。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述融合蛋白是在其N末端包含異源信號序列的UP_11或OM_10多肽。在某些宿主細(xì)胞(例如哺乳動物宿主細(xì)胞)中，用異源信號序列可以增加UP_11或OM_10多肽的表達(dá)和/或分泌。
最好通過標(biāo)準(zhǔn)重組DNA技術(shù)，產(chǎn)生UP_11或OM_10嵌合蛋白或融合蛋白。例如，按照常規(guī)技術(shù)，將編碼不同蛋白序列的DNA片段符合讀框地連接在一起，例如使用平端末端或交錯(cuò)末端用于連接，用限制酶消化以提供合適末端，適當(dāng)補(bǔ)平粘端，使用堿性磷酸酶處理以避免不希望的連接，以及用酶促連接。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可以通過常規(guī)技術(shù)合成融合基因，所述常規(guī)技術(shù)包括自動化DNA合成儀?；蛘?，可以使用錨定引物進(jìn)行基因片段的PCR擴(kuò)增，所述錨定引物在兩個(gè)連續(xù)基因片段之間產(chǎn)生互補(bǔ)突出端，所述互補(bǔ)突出端隨后可以退火，再擴(kuò)增，產(chǎn)生嵌合基因序列(參見例如Current Protocolsin Molecular Biology，Ausubel等編輯，John Wiley & Sons；1992)。此外，可以購買到已經(jīng)編碼融合部分(例如GST蛋白)的許多表達(dá)載體。可以將編碼UP_11或OM_10的核酸克隆到這樣的表達(dá)載體中，致使所述融合部分符合讀框地與UP_11或OM_10多肽連接。
C.抗UP_11抗體和抗OM_10抗體在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供與UP_11和OM_10多肽有免疫應(yīng)答的抗體。本發(fā)明的抗體最好是單克隆抗體。此外，所述UP_11和OM_10多肽包含SEQ ID NO4、SEQ ID NO7、SEQ ID NO9或SEQID NO11的氨基酸殘基序列。在某些實(shí)施方案中，包含SEQ IDNO12-16的氨基酸序列的人OM_10多肽片段用于產(chǎn)生單克隆抗血清和/或多克隆抗血清。同樣，包含SEQ ID NO17-21的氨基酸序列的人UP_11多肽片段用于產(chǎn)生單克隆血清和/或多克隆血清?？贵w的制備和表征方法是本領(lǐng)域眾所周知的(參見例如Antibodies“A LaboratoryManual，E.Howell和D.Lane，Cold Spring Harbor Laboratory，1988)。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明提供與UP_11多核苷酸和OM_10多核苷酸有免疫應(yīng)答性的抗體。
本文所用的抗體是指當(dāng)所述抗體結(jié)合UP_11或OM_10多肽時(shí)，所述抗體選擇性結(jié)合UP_11或OM_10多肽，而不選擇性結(jié)合無關(guān)蛋白。本領(lǐng)域技術(shù)人員容易了解，即使一種抗體結(jié)合與UP_11或OM_10多肽的片段或結(jié)構(gòu)域有同源性的蛋白，也可認(rèn)為該抗體在實(shí)質(zhì)上結(jié)合UP_11或OM_10多肽。
本文所用的術(shù)語“抗體”是指免疫球蛋白分子以及免疫球蛋白分子的免疫活性片段，即包含特異性結(jié)合抗原(與其發(fā)生免疫應(yīng)答)的抗原結(jié)合位點(diǎn)的分子，所述抗原例如UP_11或OM_10。免疫球蛋白分子的免疫活性片段的實(shí)例包括F(ab)片段和F(ab′)2片段，這兩種片段可以通過用酶如胃蛋白酶處理抗體而產(chǎn)生。本發(fā)明提供結(jié)合UP_11或OM_10的多克隆抗體和單克隆抗體。本文所用的術(shù)語“單克隆抗體”或“單克隆抗體組合物”是指僅包含一個(gè)種能夠與UP_11或OM_10的特定表位發(fā)生免疫應(yīng)答的抗原結(jié)合位點(diǎn)的抗體分子群體。因此，單克隆抗體組合物一般對其與之發(fā)生免疫應(yīng)答的特定UP_11或OM_10多肽表現(xiàn)出一種結(jié)合親和性。
為產(chǎn)生抗UP_11抗體或抗OM_10抗體，使用制備多克隆抗體和單克隆抗體的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，用分離的UP_11或OM_10多肽或其片段作為免疫原，產(chǎn)生結(jié)合UP_11或OM_10的抗體?？梢允褂萌LUP_11或OM_10多肽，或者可以用UP_11或OM_10的抗原性肽片段作為免疫原。UP_11或OM_10多肽的抗原性片段一般包含UP_11或OM_10多肽至少8個(gè)連續(xù)氨基酸殘基，如選自SEQ ID NO4、SEQ IDNO7、SEQ ID NO9或SEQ ID NO11的8個(gè)連續(xù)氨基酸殘基。所述抗原性肽最好包含UP_11或OM_10多肽的至少10個(gè)氨基酸殘基，更優(yōu)選至少15個(gè)氨基酸殘基，甚至更優(yōu)選至少20個(gè)氨基酸殘基，最優(yōu)選至少30個(gè)氨基酸殘基。用于產(chǎn)生抗UP_11抗體或抗OM_10抗體的優(yōu)選片段是位于UP_11或OM_10多肽表面的區(qū)，如親水性區(qū)。
通常用UP_11或OM_10免疫原免疫合適的研究對象(例如兔、山羊、小鼠或其它動物、雞)，制備抗體。合適的免疫原性制備物可以包含例如重組表達(dá)的UP_11或OM_10多肽，或者化學(xué)合成的UP_11肽或OM_10肽。所述制備物還可以包含佐劑，例如弗氏完全佐劑或弗氏不完全佐劑或者相似的免疫刺激劑。用免疫原性UP_11或OM_10制備物免疫合適研究對象，誘導(dǎo)多克隆抗UP_11或抗OM_10抗體反應(yīng)。
如上所述，可以用UP_11或OM_10免疫原免疫合適研究對象，制備多克隆抗UP_11或抗OM_10抗體。簡而言之，如下制備多克隆抗體用包含本發(fā)明多肽或多核苷酸的免疫原免疫動物，然后從免疫動物收集抗血清?？梢杂枚喾N動物生產(chǎn)抗血清。通常，用于生產(chǎn)抗血清的動物是兔、大鼠、倉鼠或豚鼠。由于兔的血體積相對較大，因此兔是用于生產(chǎn)多克隆抗體的優(yōu)選選擇。
正如本領(lǐng)域眾所周知的，給定多肽或多核苷酸可能在其免疫原性方面有所不同。因此，通常需要在本發(fā)明的免疫原(例如多肽或多核苷酸)上偶聯(lián)載體。示例性的優(yōu)選載體有匙孔蝛血藍(lán)蛋白(KLH)和牛血清白蛋白(BSA)。也可以用其它白蛋白例如卵清蛋白、鼠血清白蛋白或兔血清白蛋白作為載體。
將多肽或多核苷酸與載體多肽綴合的方法是本領(lǐng)域眾所周知的，包括戊二醛、間馬來酰亞胺基苯甲酰基-N-羥基琥珀酰胺胺酯(m-maleimidobencoyl-N-hydroxysuccinimide ester)、碳二亞胺和bis-biazotized benzidine。
正如本領(lǐng)域眾所周知的，可以通過應(yīng)用稱為佐劑的免疫應(yīng)答的非特異性刺激物，增強(qiáng)針對特定免疫原的免疫原性。示例性的優(yōu)選佐劑包括完全弗氏佐劑、不完全弗氏佐劑和氫氧化鋁佐劑。
用于生產(chǎn)多克隆抗體的免疫原用量尤其取決于所述免疫原的性質(zhì)和用于免疫的動物?？梢允褂枚喾N途徑(皮下途徑、肌內(nèi)途徑、皮內(nèi)途徑、靜脈內(nèi)途徑和胃腸外途徑)給予免疫原。免疫后在不同點(diǎn)取免疫動物的血樣，監(jiān)測多克隆抗體的產(chǎn)生。當(dāng)獲得所需水平的免疫原性時(shí)，可以給免疫動物放血，然后分離血清并貯存。
另一方面，本發(fā)明考慮生產(chǎn)與GPCR多肽發(fā)生免疫應(yīng)答的抗體的方法，所述方法包括下述步驟(a)用編碼UP_11或OM_10多肽的多核苷酸轉(zhuǎn)染重組宿主細(xì)胞；(b)在足以表達(dá)所述多肽的條件下培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞；(c)回收所述多肽；(d)制備抗所述多肽的抗體。最好用SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO5、SEQID NO6、SEQ ID NO8或SEQ ID NO10的多核苷酸轉(zhuǎn)染所述宿主細(xì)胞。甚至更優(yōu)選本發(fā)明提供按照上述方法制備的抗體。
通過使用眾所周知的技術(shù)，可以容易地制備本發(fā)明的單克隆抗體，所述技術(shù)例如在美國專利第4,196,265中舉例說明的技術(shù)，該專利通過引用結(jié)合到本文中。通常，技術(shù)涉及首先用所選抗原(例如本發(fā)明的多肽或多核苷酸)以足以引起免疫應(yīng)答的方式免疫合適的動物。嚙齒動物例如小鼠和大鼠是優(yōu)選的動物。然后使來自免疫動物的脾細(xì)胞與無限增殖骨髓瘤細(xì)胞融合。當(dāng)所述免疫動物是小鼠時(shí)，優(yōu)選的骨髓瘤細(xì)胞是鼠NS-1骨髓瘤細(xì)胞。
在選擇性培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述融合脾/骨髓瘤細(xì)胞，從親代細(xì)胞中選擇融合的脾/骨髓瘤細(xì)胞。將融合細(xì)胞與未融合的親代細(xì)胞的混合物分離開來，例如通過加入阻斷在組織培養(yǎng)基中從頭合成核苷酸的試劑。示例性的優(yōu)選試劑是氨基蝶呤、氨甲蝶呤和重氮絲氨酸。氨基蝶呤和氨甲蝶呤阻斷嘌呤和嘧啶的從頭合成，而重氮絲氨酸僅阻斷嘌呤合成。當(dāng)使用氨基蝶呤或氨甲蝶呤時(shí)，在培養(yǎng)基中補(bǔ)充次黃嘌呤和胸苷作為核苷酸源。當(dāng)使用重氮絲氨酸時(shí)，在培養(yǎng)基中補(bǔ)充次黃嘌呤。
所述培養(yǎng)產(chǎn)生雜交瘤群體，然后從中選擇出特異性雜交瘤。概括地講，如下選擇雜交瘤在微量滴定板中通過單克隆稀釋培養(yǎng)細(xì)胞，然后檢測各個(gè)克隆上清液與抗原多肽的反應(yīng)性。然后無限繁殖所選克隆，提供單克隆抗體。
下面提供產(chǎn)生本發(fā)明抗體的具體實(shí)例給小鼠腹膜內(nèi)注射包含本發(fā)明多肽的約1-200μg抗原。通過注射所述抗原以及佐劑例如完全弗氏佐劑(免疫應(yīng)答的一種非特異性刺激劑，包含滅活結(jié)核分支桿菌(Mycobacterium tuberculosis))，刺激B淋巴細(xì)胞生長。第一次注射一段時(shí)間后(例如至少兩周)，給小鼠注射第二劑與不完全弗氏佐劑混合的抗原，進(jìn)行加強(qiáng)免疫。
第二次注射后幾周，從小鼠尾取血，通過針對放射性標(biāo)記抗原的免疫沉淀滴定血清。最好重復(fù)所述加強(qiáng)免疫和滴定過程，直到獲得合適滴度。取出具有滴度最高的小鼠的脾，用注射器勻漿所述脾，獲得脾淋巴細(xì)胞。來自免疫小鼠的脾一般含有約5×107至2×108個(gè)淋巴細(xì)胞。
通過各種眾所周知的方法誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)動物體內(nèi)稱為骨髓瘤細(xì)胞的突變淋巴細(xì)胞生長，然后從所述動物獲得所述細(xì)胞。骨髓瘤細(xì)胞缺乏核苷酸生物合成的補(bǔ)救途徑。因?yàn)楣撬枇黾?xì)胞是腫瘤細(xì)胞，所以它們能夠在組織培養(yǎng)物中無限繁殖，并因此被稱為是無限增殖的。已經(jīng)建立來自小鼠和大鼠的各種骨髓瘤培養(yǎng)細(xì)胞系，例如鼠NS-1骨髓瘤細(xì)胞。
在適于促進(jìn)融合的條件下，將骨髓瘤細(xì)胞與來自用本發(fā)明抗原/多肽注射的小鼠或大鼠的脾的正?？贵w生產(chǎn)細(xì)胞混合。融合條件包括例如存在聚乙二醇。所得融合細(xì)胞是雜交瘤細(xì)胞。象骨髓瘤細(xì)胞一樣，雜交瘤細(xì)胞在培養(yǎng)物中無限生長。
在選擇性培養(yǎng)基例如HAT培養(yǎng)基(次黃嘌呤，氨基蝶呤，胸苷)中培養(yǎng)，將雜交瘤細(xì)胞與未融合骨髓瘤細(xì)胞分離開來。未融合骨髓瘤細(xì)胞缺乏從補(bǔ)救途徑合成核苷酸所需的酶，因?yàn)榫哂羞@些酶的細(xì)胞在氨基蝶呤、氨甲蝶呤或重氮絲氨酸存在下被殺死。未融合的淋巴細(xì)胞在組織培養(yǎng)物中也不能生長。因此，只有成功融合的細(xì)胞(雜交瘤細(xì)胞)才能夠在選擇培養(yǎng)基中生長。
每種存活的雜交瘤細(xì)胞生產(chǎn)一種抗體。然后根據(jù)與本發(fā)明抗原/多肽有免疫應(yīng)答性的特異性抗體的產(chǎn)生，對這些細(xì)胞進(jìn)行篩選。通過有限稀釋所述雜交瘤細(xì)胞，分離單細(xì)胞雜交瘤。多次連續(xù)稀釋所述雜交瘤，在讓所述稀釋物生長后，測試上清液中單克隆抗體的存在。然后大量培養(yǎng)產(chǎn)生所述抗體的克隆，以生產(chǎn)合適量的本發(fā)明抗體。
通過使用本發(fā)明的單克隆抗體，可以將本發(fā)明的特定多肽和多核苷酸作為抗原進(jìn)行識別，并因此鑒定它們。一旦鑒定出這些多肽和多核苷酸后，可以通過例如抗體親和層析等技術(shù)分離和純化它們。在抗體親和層析中，單克隆抗體結(jié)合固體底物，暴露于包含所需抗原的溶液。通過與結(jié)合抗體的特異性免疫反應(yīng)，從所述溶液分離所述抗原。然后容易地從底物中分離出所述多肽或多核苷酸并進(jìn)行純化。
此外，在下面參考文獻(xiàn)中可以找到尤其適用于產(chǎn)生和篩選抗體展示文庫的方法和試劑的實(shí)例例如，美國專利第5,223,409號；國際申請第WO 92/18619號；國際申請第WO 91/17271號；國際申請第WO 92/20791號；國際申請第WO 92/15679號；國際申請第WO93/01288號；國際申請第WO 92/01047號；國際申請第WO 92/09690號和國際申請第WO 90/02809號。
此外，可以使用標(biāo)準(zhǔn)重組DNA技術(shù)制備的包含人類和非人類片段的重組抗UP_11抗體或抗OM_10抗體，例如嵌合抗體和人源化單克隆抗體，也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。可以通過本領(lǐng)域已知的重組DNA技術(shù)，制備所述嵌合抗體和人源化單克隆抗體，例如使用以下文獻(xiàn)中介紹的方法美國專利第6,054,297號；歐洲申請第EP 184,187號；第EP 171,496號；第EP 173,494號；國際申請第WO 86/01533號；美國專利第4,816,567號；以及歐洲申請第EP 125,023號。
可以通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，用抗UP_11多肽抗體或抗OM_10多肽抗體(例如單克隆抗體)分離UP_11或OM_10多肽，所述標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)例如親和層析或免疫沉淀。
抗UP_11多肽抗體或抗OM_10多肽抗體可以方便純化細(xì)胞內(nèi)的天然UP_11或OM_10多肽，以及宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的重組產(chǎn)生的UP_11或OM_10多肽。此外，可以使用抗UP_11多肽抗體或OM_10多肽抗體檢測UP_11或OM_10多肽(例如在細(xì)胞裂解物或細(xì)胞上清液內(nèi))，以評價(jià)UP_11或OM_10多肽表達(dá)的豐度和模式。對UP_11或OM_10多肽循環(huán)片段的檢測可以用于鑒定研究對象體內(nèi)的UP_11或OM_10多肽更新?？筓P_11抗體或抗OM_10抗體可以在診斷上用于監(jiān)測組織內(nèi)的蛋白水平，作為臨床試驗(yàn)程序的一部分，例如用于確定給定治療方案的功效。通過將所述抗體偶聯(lián)(即物理連接)到可檢測物質(zhì)上，可以便利檢測?？蓹z測物質(zhì)的實(shí)例包括各種酶、輔基、熒光材料、發(fā)光材料、生物發(fā)光材料和放射性材料。合適酶的實(shí)例包括辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、P-半乳糖苷酶或乙酰膽堿酯酶；合適輔基復(fù)合物的實(shí)例包括鏈霉抗生物素蛋白/生物素和抗生物素蛋白/生物素；合適熒光材料的實(shí)例包括傘形酮、熒光素、異硫氰酸熒光素、若丹明、dichlorotriazinylarnine fluorescein、丹磺酰氯或藻紅蛋白；發(fā)光材料的實(shí)例包括魯米諾；生物發(fā)光材料的實(shí)例包括螢光素酶、螢光素和acquorin，而合適放射性材料的實(shí)例包括125I、131I、15S或3H。
D.重組表達(dá)載體和宿主細(xì)胞在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包含編碼UP_11或OM_10多肽的多核苷酸的表達(dá)載體。本發(fā)明的表達(dá)載體最好包含以下多核苷酸所述多核苷酸編碼具有SEQ ID NO4、SEQ ID NO7、SEQ IDNO9或SEQ ID NO11的氨基酸殘基序列的多肽。更優(yōu)選本發(fā)明的表達(dá)載體包含以下多核苷酸所述多核苷酸包含SEQ ID NO1、SEQID NO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO5、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8或SEQ ID NO的核苷酸堿基序列。甚至更優(yōu)選本發(fā)明的表達(dá)載體包含有效連接增強(qiáng)子-啟動子的多核苷酸。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的表達(dá)載體包含有效連接原核啟動子的多核苷酸?；蛘撸景l(fā)明的表達(dá)載體包含有效連接增強(qiáng)子-啟動子的多核苷酸，其中所述增強(qiáng)子-啟動子是真核啟動子，所述表達(dá)載體還包含位于羧基末端氨基酸3′以及在編碼多肽的轉(zhuǎn)錄單位內(nèi)的聚腺苷酸化信號。
本文所用的術(shù)語“載體”是指能夠轉(zhuǎn)運(yùn)其連接的另一種核酸的核酸分子。一種載體類型是“質(zhì)?！?，是指可以在其中連接其它DNA區(qū)段的環(huán)狀雙鏈DNA環(huán)。另一種載體類型是病毒載體，其中可以將其它DNA區(qū)段連接到病毒基因組中。某些載體能夠在它們所導(dǎo)入的宿主細(xì)胞中自主復(fù)制(例如具有細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)的細(xì)菌載體和附加型哺乳動物載體)。其它載體(例如非附加型哺乳動物載體)在導(dǎo)入宿主細(xì)胞后整合到宿主細(xì)胞基因組，從而隨宿主基因組一起復(fù)制。此外，某些載體能夠指導(dǎo)它們有效連接的基因的表達(dá)。所述載體在本文中稱為“表達(dá)載體”。一般而言，在重組DNA技術(shù)中應(yīng)用的表達(dá)載體通常為質(zhì)粒形式。在本說明書中，“質(zhì)粒”和“載體”可以互換使用，因?yàn)橘|(zhì)粒是最常用的載體形式。然而，本發(fā)明還包括有等同功能的其它形式表達(dá)載體，例如病毒載體(例如復(fù)制缺陷型逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒和腺伴隨病毒)。
原核生物中的蛋白表達(dá)最通常在大腸桿菌內(nèi)進(jìn)行，使用包含指導(dǎo)融合蛋白或非融合蛋白表達(dá)的組成型或誘導(dǎo)型啟動子的載體。融合載體在其所編碼的蛋白內(nèi)加入多個(gè)氨基酸，加在重組蛋白的氨基端或羧基端。所述融合載體通常有三個(gè)目的1)增加重組蛋白的表達(dá)；2)增加所述重組蛋白的溶解度；和3)通過作為親和純化中的配體，有助于純化所述重組蛋白。在融合表達(dá)載體中，通常在融合部分和重組蛋白的連接處引入蛋白酶切割位點(diǎn)，使得能夠?qū)⑺鲋亟M蛋白與所述融合部分分離開來，隨后純化所述融合蛋白。所述酶及其關(guān)連識別序列包括Xa因子、凝血酶和腸激酶。
典型的融合表達(dá)載體包括pGEX(Pharmacia Biotech Inc；Smith和Johnson，1988)、pMAL(NeW England Biolabs，Beverly；MA)和pRIT5(Pharmacia，Piscataway，NJ)，所述表達(dá)載體分別將谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)、麥芽糖E結(jié)合蛋白或A蛋白與靶重組蛋白融合。
在一個(gè)實(shí)施方案中，將UP_11或OM_10基因的編碼序列克隆到pGEX表達(dá)載體中，產(chǎn)生編碼融合蛋白的載體，所述融合蛋白從N末端到C末端包含GST-凝血酶切割位點(diǎn)-UP_11或OM_10多肽?？梢允褂霉入赘孰?瓊脂糖樹脂，通過親和層析純化所述融合蛋白。通過用凝血酶切割所述融合蛋白，可以回收未與GST融合的重組UP_11或OM_10多肽。
合適的誘導(dǎo)型非融合大腸桿菌表達(dá)載體的實(shí)例包括pTrc(Amann等，1988)和pET IId(Studier等，1990)。從pTrc載體的靶基因表達(dá)依賴于宿主RNA聚合酶從雜種trp-lac融合啟動子開始的轉(zhuǎn)錄。從pETIId載體的靶基因表達(dá)依賴于共表達(dá)的病毒RNA聚合酶J7 gnl介導(dǎo)的從T7 gnl 0-lac融合啟動予開始的轉(zhuǎn)錄。該病毒聚合酶由宿主株BL21(DE3)或HMS I 74(DE3)從居留原噬菌體提供，所述居留原噬菌體攜帶在lacUV 5啟動子轉(zhuǎn)錄控制下的T7 gnl基因。
最大化大腸桿菌中重組蛋白表達(dá)的一個(gè)策略是在蛋白水解所述重組蛋白的能力受損的宿主細(xì)菌中表達(dá)所述蛋白。另一個(gè)策略是改變要插入表達(dá)載體的核酸的核酸序列，以便每個(gè)氨基酸的各個(gè)密碼子是在大腸桿菌中偏倚利用的那些密碼子?？梢酝ㄟ^標(biāo)準(zhǔn)DNA誘變技術(shù)或合成技術(shù)，進(jìn)行本發(fā)明對核酸序列的所述改變。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述UP_11或OM_10多核苷酸表達(dá)載體是酵母表達(dá)載體。在釀酒酵母(S.cerivisae)中的表達(dá)載體的實(shí)例包括pYepSec I(Baldari等，1987)、pMFa(Kurjan和Herskowitz，1982)、pJRY88(Schultz等，1987)和pYES2(Invitrogen Corporation，San Diego，CA)。
或者，可以使用例如桿狀病毒表達(dá)載體，在昆蟲細(xì)胞內(nèi)表達(dá)UP_11多核苷酸或OM_10多核苷酸。在培養(yǎng)的昆蟲細(xì)胞(例如Sf9細(xì)胞)中表達(dá)蛋白可利用的桿狀病毒載體包括pAc系列(Smith等，1983)和pVL系列(Lucklow和Summers，1989)。
在又一個(gè)實(shí)施方案中，使用哺乳動物表達(dá)載體，在哺乳動物細(xì)胞內(nèi)表達(dá)本發(fā)明的多核苷酸。哺乳動物表達(dá)載體的實(shí)例包括pCDM8(Seed，1987)和pMT2PC(Kaufman等，1987)。當(dāng)在哺乳動物細(xì)胞內(nèi)使用時(shí)，所述表達(dá)載體的控制功能通常由病毒調(diào)節(jié)元件提供。
例如，常用的啟動子來自多形瘤、腺病毒2、巨細(xì)胞病毒和猿猴病毒40。對于既在原核細(xì)胞又在真核細(xì)胞中使用的其它合適的表達(dá)系統(tǒng)，參見Sambrook等，“Molecular CloningA Laboratory Manual”第二版，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，NY，1989的第16章和第17章，該文獻(xiàn)通過引用全部結(jié)合到本文中。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述重組哺乳動物表達(dá)載體能夠指導(dǎo)所述核酸優(yōu)先在特定細(xì)胞類型內(nèi)表達(dá)(例如用組織特異性調(diào)節(jié)元件表達(dá)所述核酸)。組織特異性調(diào)節(jié)元件是本領(lǐng)域已知的。合適的組織特異性啟動子的非限制性實(shí)例包括白蛋白啟動子(肝特異性；Pinkert等，1987)、淋巴特異性啟動子(Calame和Eaton，1988)，尤其是T細(xì)胞受體啟動子(Winoto和Baltimore，1989)和免疫球蛋白啟動子(Banerji等，1983，Queen和Baltimore，1983)、神經(jīng)元特異性啟動子(例如神經(jīng)絲啟動子；Byrne和Ruddle，1989)、胰腺特異性啟動子(Edlund等，1985)和乳腺特異性啟動子(例如乳清蛋白啟動子；美國專利第4,873,316號和歐洲申請第EP 264,166號)。也包括發(fā)育調(diào)節(jié)的啟動子，例如鼠hox啟動子(Kessel和Gruss，1990)和甲胎蛋白啟動子(Campes和Tilghman，1989)。
本發(fā)明還涉及用于體外生產(chǎn)UP_11或OM_10多肽以及通過基因治療傳遞UP_11或OM_10多肽的改良方法。本發(fā)明包括激活內(nèi)源細(xì)胞基因表達(dá)并進(jìn)一步允許活化內(nèi)源細(xì)胞基因擴(kuò)增的方法，所述方法不需要編碼UP_11或OM_10多肽的外源DNA的體外操作和轉(zhuǎn)染。這些方法在以下文獻(xiàn)中有描述PCR國際申請WO 94/12650、美國專利第5,968,502號和Harrington等，2001，所有這些文獻(xiàn)通過引用全部結(jié)合到本文中。這些方法以及本領(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)為等同的這些方法的改變形式統(tǒng)稱為“基因激活”。
因此，在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及用于生產(chǎn)蛋白的轉(zhuǎn)染細(xì)胞、制備所述細(xì)胞的方法、使用所述細(xì)胞體外生產(chǎn)蛋白的方法以及基因治療的方法，其中所述轉(zhuǎn)染細(xì)胞包括原代細(xì)胞或二代細(xì)胞(即非無限增殖化細(xì)胞)和轉(zhuǎn)染的無限增殖化細(xì)胞。本發(fā)明的細(xì)胞來源于脊椎動物，具體地說來源于哺乳動物，甚至更具體地講來源于人。用本發(fā)明方法產(chǎn)生的細(xì)胞含有下面的外源DNA編碼治療藥物的外源DNA，本身是治療藥物的外源DNA，和/或使所述轉(zhuǎn)染細(xì)胞以比相應(yīng)未轉(zhuǎn)染細(xì)胞更高水平表達(dá)基因或以與相應(yīng)未轉(zhuǎn)染細(xì)胞內(nèi)存在的不同調(diào)節(jié)或誘導(dǎo)模式表達(dá)基因的外源DNA。
本發(fā)明還涉及轉(zhuǎn)染原代細(xì)胞、二代細(xì)胞和無限增殖化細(xì)胞以包括外源遺傳材料的方法，產(chǎn)生克隆細(xì)胞株或異源細(xì)胞株的方法，以及使用所述轉(zhuǎn)染的原代細(xì)胞、二代細(xì)胞或無限增殖化細(xì)胞免疫動物或在免疫動物體內(nèi)產(chǎn)生抗體的方法。
本發(fā)明尤其涉及在來源于脊椎動物細(xì)胞、尤其是來源于哺乳動物細(xì)胞中基因打靶或同源重組的方法。也就是說，本發(fā)明涉及以下方法通過同源重組將DNA導(dǎo)入源自脊椎動物的原代細(xì)胞、二代細(xì)胞或無限增殖化細(xì)胞，使得將所述DNA導(dǎo)入所述原代細(xì)胞、二代細(xì)胞或無限增殖化細(xì)胞基因組DNA內(nèi)的預(yù)選位點(diǎn)。所用的打靶序列由所述外源DNA要插入的位點(diǎn)決定(或參考所述位點(diǎn)選定)。在這些方法中使用本發(fā)明提供的cDNA UP_11或OM_10序列(即SEQ IDNO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO5、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8、SEQ ID NO10)。本發(fā)明還涉及用本發(fā)明方法產(chǎn)生的同源重組的原代細(xì)胞、二代細(xì)胞或無限增殖化細(xì)胞，稱之為同源重組(HR)原代細(xì)胞、二代細(xì)胞或無限增殖化細(xì)胞，以及所述HR原代細(xì)胞、二代細(xì)胞或無限增殖化細(xì)胞的應(yīng)用。
本發(fā)明還涉及激活(即啟動表達(dá))來源于脊椎動物的原代細(xì)胞、二代細(xì)胞或無限增殖化細(xì)胞內(nèi)存在的UP_11或OM_10基因的方法，其中UP_11或OM_10基因通常在所述細(xì)胞中不表達(dá)，或者不象所獲得細(xì)胞那樣以生理顯著水平表達(dá)。根據(jù)本發(fā)明，用同源重組取代調(diào)節(jié)序列所獲得的細(xì)胞中與所述基因正常結(jié)合的調(diào)節(jié)區(qū)或者使所述調(diào)節(jié)區(qū)失活，所述新調(diào)節(jié)序列使所述基因以比相應(yīng)非轉(zhuǎn)染細(xì)胞顯著更高的水平表達(dá)，或者使所述基因以與相應(yīng)非轉(zhuǎn)染細(xì)胞中明顯不同的調(diào)節(jié)模式或誘導(dǎo)模式表達(dá)。因此，本發(fā)明涉及制備蛋白的方法，所述方法啟動表達(dá)或激活在轉(zhuǎn)染原代細(xì)胞、二代細(xì)胞或無限增殖化細(xì)胞中編碼所需產(chǎn)物的內(nèi)源基因。
在一個(gè)實(shí)施方案中，可以通過包括選擇標(biāo)記基因，進(jìn)一步擴(kuò)增所述活化基因，所述選擇標(biāo)記具有如下性質(zhì)通過在合適選擇劑存在下培養(yǎng)所述細(xì)胞，可以選擇包含所述選擇標(biāo)記基因擴(kuò)增拷貝的細(xì)胞。在包含擴(kuò)增的所述選擇標(biāo)記基因的細(xì)胞中，在擴(kuò)增的選擇標(biāo)記基因附近或與其連接的活化內(nèi)源基因也得到擴(kuò)增。包含許多拷貝所述活化內(nèi)源基因的細(xì)胞可用于體外蛋白生產(chǎn)和基因治療。
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明還涉及激活細(xì)胞中內(nèi)源基因表達(dá)的方法，或者通過非同源重組或隨機(jī)激活基因表達(dá)(RAGE)過量表達(dá)細(xì)胞中內(nèi)源基因的方法。所述方法包括將載體導(dǎo)入細(xì)胞中，允許所述載體通過非同源重組整合到所述細(xì)胞的基因組中，然后允許細(xì)胞中內(nèi)源基因的激活或者過量表達(dá)。非同源重組或“非靶向”重組的應(yīng)用不需要事先對所述內(nèi)源基因序列有所認(rèn)識。通過非同源重組表達(dá)內(nèi)源基因和制備用于非同源重組的載體構(gòu)建體的方法在國際專利申請WO 99/15650和WO 00/49162中有描述，這兩個(gè)專利通過引用全部結(jié)合到本文中。
在非同源重組事件中使用的載體構(gòu)建體應(yīng)當(dāng)包含至少一個(gè)與未配對剪接供體序列有效連接的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列，以及一個(gè)或多個(gè)可擴(kuò)增標(biāo)記。所述轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列通常是但不限于啟動子序列。所述轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列除啟動子序列外，還可以包括增強(qiáng)子序列。所述轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列有效連接一個(gè)翻譯起始密碼子、一個(gè)信號分泌序列和一個(gè)未配對剪接供體位點(diǎn)。所述轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列可另外有效連接一個(gè)翻譯起始密碼子、一個(gè)附加表位和一個(gè)未配對剪接供體位點(diǎn)；或者有效連接一個(gè)翻譯起始密碼子、一個(gè)信號分泌序列、一個(gè)附加表位和一個(gè)未配對剪接供體位點(diǎn)；或者有效連接一個(gè)翻譯起始密碼子、一個(gè)信號分泌序列、一個(gè)附加表位、一個(gè)序列特異性蛋白酶位點(diǎn)和一個(gè)未配對剪接供體位點(diǎn)。
可用于上述載體的可擴(kuò)增標(biāo)記的實(shí)例包括但不限于二氫葉酸還原酶(DHFR)、新霉素抗性(neo)、次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(HPRT)、嘌呤霉素(pac)、腺苷脫氨酶(ada)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶(ATC)、二氫乳清酸酶、D型組氨酸(his D)、多藥物抗性1(mdr 1)、黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(gpy)、谷氨酰胺合成酶(GS)和氨甲酰磷酸合成酶(CAD)。所述載體還可以包括篩選標(biāo)記，例如編碼細(xì)胞表面蛋白、熒光蛋白和/或酶的基因。在所述“激活”載體構(gòu)建體中可以包括信號分泌序列，以便分泌活化基因表達(dá)產(chǎn)物。
所述載體構(gòu)建體的調(diào)節(jié)序列可以是組成型啟動子、誘導(dǎo)型啟動子或組織特異性啟動子或增強(qiáng)子。應(yīng)用誘導(dǎo)型啟動子將允許在常規(guī)培養(yǎng)和擴(kuò)增期間，所述細(xì)胞產(chǎn)生低基礎(chǔ)水平的活化蛋白。隨后在生產(chǎn)或篩選期間，可以誘導(dǎo)所述細(xì)胞表達(dá)大量所需蛋白?？梢詮募?xì)胞基因組或病毒基因組分離調(diào)節(jié)序列。細(xì)胞調(diào)節(jié)序列的實(shí)例包括但不限于肌動蛋白基因、金屬硫蛋白I基因、膠原蛋白基因、血清白蛋白基因和免疫球蛋白基因。病毒調(diào)節(jié)序列的實(shí)例包括但不限于來自巨細(xì)胞病毒屬(Cytomegalovirus，CMV)立即早期基因、腺病毒晚期基因、SV40基因、逆轉(zhuǎn)錄病毒LTR和皰疹病毒屬(Herpesvirus)基因的調(diào)節(jié)元件(其它組織特異性調(diào)節(jié)序列和誘導(dǎo)型調(diào)節(jié)序列分別參見表3和表4)。
對初級轉(zhuǎn)錄物的剪接，及去除內(nèi)含子的過程，由分別位于內(nèi)含子5′和3′的剪接供體位點(diǎn)和剪接受體位點(diǎn)指導(dǎo)。剪接供體位點(diǎn)的共有序列是(A/C)AGGURAGU(其中R代表嘌呤核苷酸)，其中位置1-3的核苷酸(A/C)AG位于外顯子內(nèi)，而核苷酸GURAGU位于內(nèi)含子內(nèi)。
未配對的剪接供體位點(diǎn)在本文中定義為存在于載體構(gòu)建體上、沒有下游剪接受體位點(diǎn)的剪接供體位點(diǎn)。當(dāng)所述載體通過非同源重組整合到宿主細(xì)胞基因組中時(shí)，所述未配對的剪接供體位點(diǎn)與內(nèi)源基因的剪接受體位點(diǎn)配對。來自所述載體構(gòu)建體的剪接供體位點(diǎn)和來自內(nèi)源基因的剪接受體位點(diǎn)將一起指導(dǎo)所述載體供體位點(diǎn)和所述內(nèi)源剪接受體位點(diǎn)之間所有序列的切除。切除這些間插序列將除去干擾所述內(nèi)源蛋白翻譯的序列。
啟動子是DNA分子的一個(gè)區(qū)，通常位于轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)(即轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn))前面(上游)約100個(gè)核苷酸對以內(nèi)。該區(qū)通常包含位于不同基因中處于相似的相對位置的幾種類型DNA序列元件。本文所用的術(shù)語“啟動子”包括在本領(lǐng)域所指的上游啟動子區(qū)、啟動子區(qū)或者通用真核RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄單位的啟動子。
另一種類型獨(dú)立存在的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列元件是增強(qiáng)子。增強(qiáng)子為特定編碼區(qū)(例如基因)提供時(shí)間、位置和表達(dá)水平特異性。增強(qiáng)子的主要功能是在包含結(jié)合所述增強(qiáng)子的一個(gè)或多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子的細(xì)胞內(nèi)，增加編碼序列的轉(zhuǎn)錄水平。與啟動子不同，只要啟動子存在，增強(qiáng)子就能在與轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)不同距離的地方起作用。
本文所用的詞組“增強(qiáng)子-啟動子”是指包含增強(qiáng)子元件和啟動子元件的復(fù)合單位。增強(qiáng)子-啟動子與編碼至少一種基因產(chǎn)物的編碼序列有效連接。本文所用的詞組“有效連接”是指增強(qiáng)子-啟動子與所述編碼序列的連接方式使得編碼序列的轉(zhuǎn)錄受到所述增強(qiáng)子-啟動子控制和調(diào)節(jié)。將增強(qiáng)子-啟動子有效連接到編碼序列的方法是本領(lǐng)域眾所周知的。另外，正如本領(lǐng)域眾所周知的，增強(qiáng)子-啟動子相對于轉(zhuǎn)錄受到它們控制的編碼序列的精確取向和位置，尤其取決于所述增強(qiáng)子-啟動子的具體性質(zhì)。因此，TATA框最小化啟動子一般位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游約25個(gè)到約30個(gè)堿基對，上游啟動子元件一般位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游約100個(gè)到約200個(gè)堿基對。與此不同，增強(qiáng)子可以位于起始位點(diǎn)下游，并且可以距離所述位點(diǎn)相當(dāng)遠(yuǎn)的距離。
表達(dá)載體的編碼序列有效連接到轉(zhuǎn)錄終止區(qū)。RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄編碼DNA序列通過聚腺苷酸化出現(xiàn)的位點(diǎn)。通常，位于所述聚腺苷酸化位點(diǎn)下游幾百個(gè)堿基對的DNA序列終止轉(zhuǎn)錄。這些DNA序列在本文中稱為轉(zhuǎn)錄終止區(qū)。這些區(qū)是轉(zhuǎn)錄的信使RNA(mRNA)有效腺苷酸化所需的。轉(zhuǎn)錄終止區(qū)是本領(lǐng)域眾所周知的。本發(fā)明腺病毒載體構(gòu)建體中所用的優(yōu)選轉(zhuǎn)錄-終止區(qū)包含SV40或魚精蛋白基因的聚腺苷酸化信號。
表3.組織特異性啟動子
表4.誘導(dǎo)型啟動子
表達(dá)或過量表達(dá)目標(biāo)基因的細(xì)胞可以在以下條件下進(jìn)行體外培養(yǎng)所述條件有利于以所需量生產(chǎn)已經(jīng)被激活或其表達(dá)已經(jīng)得到增加的內(nèi)源基因的表達(dá)產(chǎn)物。也可以在以下條件下，將包含已經(jīng)整合到其基因組的載體構(gòu)建體的細(xì)胞導(dǎo)入真核生物(例如脊椎動物，優(yōu)選哺乳動物，更優(yōu)選人)所述條件有利于在所述真核生物體內(nèi)由所述細(xì)胞激活或過量表達(dá)所述基因。在具體實(shí)施方案中，產(chǎn)生基因組轉(zhuǎn)錄文庫和蛋白表達(dá)文庫(Harrington等，2001)。使用上述用于非同源重組的載體構(gòu)建體，通過隨機(jī)激活基因表達(dá)(RAGE)產(chǎn)生文庫。
宿主細(xì)胞可來源于任何真核生物，可以是原代細(xì)胞、二代細(xì)胞或無限增殖細(xì)胞。此外，所述細(xì)胞可以來源于生物體內(nèi)的任何組織。可以分離和激活細(xì)胞的有用組織的實(shí)例包括但不限于肝、脾、腎、骨髓、胸腺、心臟、肌肉、肺、腦、睪丸、卵巢、胰島、腸、皮膚、膽囊、前列腺、膀胱和免疫造血系統(tǒng)。
可以將所述載體構(gòu)建體整合到原代細(xì)胞、二代細(xì)胞或無限增殖化細(xì)胞中。原代細(xì)胞是已經(jīng)從脊椎動物分離并且沒有經(jīng)歷傳代的細(xì)胞。二代細(xì)胞是已經(jīng)歷傳代但沒有無限增殖化的原代細(xì)胞。無限增殖化細(xì)胞是明顯可以無限傳代的細(xì)胞系。無限增殖化細(xì)胞系的實(shí)例包括但不限于HT1080、HeLa、Jurkat、293細(xì)胞、KB癌、T84結(jié)腸上皮細(xì)胞系、Raji、Hep G2或Hep 3B、肝癌細(xì)胞系、A2058黑素瘤、U937淋巴瘤和WI38成纖維細(xì)胞系、體細(xì)胞雜種和雜交瘤。
因此，為通過非同源重組激活本發(fā)明的內(nèi)源基因，技術(shù)人員可以產(chǎn)生包含一個(gè)調(diào)節(jié)序列、一個(gè)或多個(gè)可擴(kuò)增標(biāo)記、一個(gè)附加表位或一個(gè)分泌信號序列以及一個(gè)未配對剪接供體序列的“激活”載體構(gòu)建體。然后通過本領(lǐng)域任何已知的轉(zhuǎn)染方法，將所述激活構(gòu)建體導(dǎo)入優(yōu)選的真核宿主細(xì)胞中。將所述載體導(dǎo)入細(xì)胞后，允許所述DNA通過非同源重組整合到宿主細(xì)胞基因組。整合可以發(fā)生在自發(fā)斷裂的染色體或人工誘導(dǎo)斷裂(例如γ輻射、限制酶)的染色體上。所述載體整合到宿主細(xì)胞基因組后，通過同時(shí)或順序選擇位于整合載體構(gòu)建體上的一個(gè)或多個(gè)可擴(kuò)增標(biāo)記，可以以拷貝數(shù)量擴(kuò)增基因座。該方法便于分離已經(jīng)擴(kuò)增包含所述整合載體的基因座的細(xì)胞克隆。分離和分選包含所述活化基因的細(xì)胞，通過基于PCR的克隆分離活化內(nèi)源基因(詳細(xì)實(shí)驗(yàn)方法參見國際申請WO 99/15650，該申請通過引用全部結(jié)合到本文中)。然而，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將會認(rèn)識到，可以等同地使用任何本領(lǐng)域已知的克隆基因的方法，從分選的細(xì)胞中分離出活化基因。
本發(fā)明的轉(zhuǎn)染細(xì)胞可用于人類和動物中的多種應(yīng)用(例如活體外操作)。在一個(gè)實(shí)施方案中，可以將所述細(xì)胞植入人或動物體內(nèi)，用于將UP_11或OM_10多肽傳遞到所述人或動物?？梢詫P_11或OM_10多肽系統(tǒng)地或局部地傳遞到人體內(nèi)，獲得治療益處。可以使用屏障裝置將細(xì)胞保留在體內(nèi)的固定位置，或者保護(hù)所述細(xì)胞并使所述細(xì)胞與宿主免疫系統(tǒng)分離，所述屏障裝置包含表達(dá)治療性UP_11或OM_10多肽產(chǎn)物的轉(zhuǎn)染細(xì)胞，并且治療產(chǎn)物是自由滲透的。屏障裝置尤其有用，允許移植轉(zhuǎn)染的無限增殖化細(xì)胞、來自另一物種的轉(zhuǎn)染細(xì)胞(轉(zhuǎn)染的異種細(xì)胞)或者來自非組織相容性匹配供體的細(xì)胞(轉(zhuǎn)染的同種異體基因細(xì)胞)，以治療人類或動物的病癥。屏障裝置也允許常規(guī)的短期(即瞬時(shí))治療，即當(dāng)治療方案由于任何原因需要中止時(shí)，容易接近需去除的細(xì)胞。轉(zhuǎn)染的異種和同種異體基因細(xì)胞也可以用于短期基因治療，以便可以體內(nèi)傳遞所述細(xì)胞產(chǎn)生的基因產(chǎn)物，直到細(xì)胞受到宿主免疫系統(tǒng)的排斥。
本發(fā)明的轉(zhuǎn)染細(xì)胞也用于引發(fā)抗體產(chǎn)生，或者用于免疫人類和動物，使其抵抗致病生物。植入的轉(zhuǎn)染細(xì)胞可以用于傳遞免疫抗原，所述免疫抗原導(dǎo)致刺激宿主細(xì)胞免疫應(yīng)答和體液免疫應(yīng)答?？梢栽O(shè)計(jì)這些免疫應(yīng)答，以保護(hù)宿主免受未來的傳染性生物的攻擊(即接種疫苗)、刺激和增加抵抗正在進(jìn)行的感染的抗病能力、或者產(chǎn)生針對所述轉(zhuǎn)染細(xì)胞體內(nèi)產(chǎn)生的抗原的抗體，所述抗體可以用于治療或診斷目的。可以使用可移除的屏障裝置，允許終止暴露于所述抗原的簡單方法。或者，可以使用最終將會被排斥的細(xì)胞(異種或同種異體基因的轉(zhuǎn)染細(xì)胞)，限制接觸所述抗原，因?yàn)楫?dāng)所述細(xì)胞受到排斥后，抗原產(chǎn)生將停止。
本發(fā)明的方法可用于生產(chǎn)那些產(chǎn)生UP_11或OM_10多肽產(chǎn)物或反義RNA的原代細(xì)胞、二代細(xì)胞或無限增殖化細(xì)胞。此外，本發(fā)明的方法可用于生產(chǎn)那些產(chǎn)生非天然存在的核酶、蛋白或核酸的細(xì)胞，所述細(xì)胞用于體外生產(chǎn)UP_11域OM_10治療性產(chǎn)物或用于基因治療。
本發(fā)明還提供重組表達(dá)載體，所述重組表達(dá)載體包含以反義方向克隆到所述表達(dá)載體的UP_11或OM_10多肽編碼DNA分子。也就是說，所述DNA分子以一定方式有效連接調(diào)節(jié)序列，所述方式允許表達(dá)(通過轉(zhuǎn)錄所述DNA分子)與UP_11或OM_10 mRNA反義的RNA分子。可以選擇有效連接到以反義取向克隆的核酸的如負(fù)調(diào)節(jié)序列指導(dǎo)所述反義RNA分子在各種細(xì)胞類型中連續(xù)表達(dá)的調(diào)節(jié)序列，如病毒啟動子和/或增強(qiáng)子；或者指導(dǎo)反義RNA組成型、組織特異性或細(xì)胞類型特異性表達(dá)的調(diào)節(jié)序列。所述反義表達(dá)載體可以為重組質(zhì)粒、噬菌?；驕p毒病毒的形式，其中反義核酸處于高效調(diào)節(jié)區(qū)的控制下產(chǎn)生，可以根據(jù)所述載體所導(dǎo)入的細(xì)胞類型確定其活性。
本發(fā)明的另一方面涉及已經(jīng)引入本發(fā)明重組表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。術(shù)語“宿主細(xì)胞”和“重組宿主細(xì)胞”在本文中可以互換使用。應(yīng)當(dāng)理解，所述術(shù)語不僅指特定的研究細(xì)胞，而且指所述細(xì)胞的后代或潛在后代。由于突變或者環(huán)境影響，某些修飾可能出現(xiàn)在后續(xù)世代中，因此，實(shí)際上所述后代可能與親代細(xì)胞不相同，但仍然包括在本文所用的術(shù)語范圍內(nèi)。宿主細(xì)胞可以是任何原核細(xì)胞或真核細(xì)胞。例如，可以在細(xì)菌細(xì)胞如大腸桿菌、昆蟲細(xì)胞、酵母或哺乳動物細(xì)胞(例如中國倉鼠卵巢細(xì)胞(CHO)或COS細(xì)胞)中表達(dá)UP_11或OM_10多肽。其它合適的宿主細(xì)胞是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。
可以通過常規(guī)轉(zhuǎn)化、感染或轉(zhuǎn)染技術(shù)將載體DNA導(dǎo)入真核細(xì)胞或原核細(xì)胞中。本文所用的術(shù)語“轉(zhuǎn)化”和“轉(zhuǎn)染”是指多種本領(lǐng)域公知的用于將外源核酸(例如DNA)導(dǎo)入宿主細(xì)胞中的技術(shù)，包括磷酸鈣或氯化鈣共沉淀、DEAE-葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染法或電穿孔法。在Sambrook等，(“Molecular CloningA Laboratory Manual”第二版，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，NY，1989)和其它實(shí)驗(yàn)室手冊中，可以找到用于轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞的合適方法。
為穩(wěn)定轉(zhuǎn)染哺乳動物細(xì)胞，根據(jù)所使用的表達(dá)載體和轉(zhuǎn)染技術(shù)，已知只有少部分細(xì)胞可能將外源DNA整合到它們的基因組中。為鑒定和選擇這些整合子，通常將編碼選擇標(biāo)記(例如抗生素抗性)的基因與目標(biāo)基因一起導(dǎo)入宿主細(xì)胞中。優(yōu)選的選擇標(biāo)記包括那些賦予藥物抗性的選擇標(biāo)記，所述藥物例如G418、潮霉素和氨甲蝶呤。編碼選擇標(biāo)記的核酸可以在編碼UP_11或OM_10多肽的同一載體上導(dǎo)入宿主細(xì)胞，或者在不同載體上導(dǎo)入宿主細(xì)胞?？梢酝ㄟ^藥物選擇，鑒定用導(dǎo)入的核酸穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞(例如，加入選擇標(biāo)記基因的細(xì)胞將存活，而其它細(xì)胞死亡)。
本發(fā)明的宿主細(xì)胞，如培養(yǎng)物中的原核宿主細(xì)胞或真核宿主細(xì)胞，可以用于生產(chǎn)(即表達(dá))UP_11或OM_10多肽。因此，本發(fā)明還提供使用本發(fā)明宿主細(xì)胞生產(chǎn)UP_11或OM_10多肽的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法包括在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)本發(fā)明的宿主細(xì)胞(在所述細(xì)胞中導(dǎo)入了編碼UP_11或OM_10多肽的重組表達(dá)載體)直到產(chǎn)生UP_11或OM_10多肽。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法還包括從培養(yǎng)基或宿主細(xì)胞中分離UP_11或OM_10多肽。
表達(dá)載體包含編碼UP_11或OM_10多肽的多核苷酸。所述多核苷酸將包括編碼UP_11或OM_10多肽的核苷酸堿基序列，所述核苷酸堿基序列足夠長，能夠?qū)⑺鲂蛄卸闻c編碼非UP_11多肽或非OM_10多肽的多核苷酸序列段分開。本發(fā)明的多核苷酸也可以編碼具有變異體氨基酸序列的生物學(xué)上功能性多肽或肽，所述變異體氨基酸序列例如具有根據(jù)各種考慮而所選的改變，所述考慮例如互換的氨基酸的相對親水分值。這些變異體序列是那些從天然來源的變異體序列中分離的，或者使用誘變程序如定點(diǎn)誘變由本文公開的序列誘導(dǎo)的變異體序列。
本發(fā)明的表達(dá)載體優(yōu)選包括編碼包含如下多核苷酸所述多核苷酸編碼包含SEQ ID NO4、SEQ ID NO7、SEQ ID NO9或SEQ IDNO11的氨基酸殘基序列的多肽。表達(dá)載體可以包括UP_11或OM_10多肽編碼區(qū)本身，或者上文提到的任何UP_11或OM_10多肽，或者它可以包含在所述UP_11或OM_10多肽的基本編碼區(qū)具有所選改變或修飾的編碼區(qū)?；蛘撸鲚d體或者片段可以編碼更大的多肽或仍然包括基本編碼區(qū)的多肽。在任何情況下，應(yīng)當(dāng)認(rèn)識到，由于密碼子簡并性以及生物學(xué)功能等同性，本發(fā)明的這一方面不限于對應(yīng)于上文提到的多肽序列的具體DNA分子。
示例性的載體包括pCMV家族的哺乳動物表達(dá)載體，包括pCMV6b和pCMV6c(Chiron Corp.，Emeryville CA.)。在某些情況下，尤其是在這些單獨(dú)的哺乳動物表達(dá)載體的情況下，所得構(gòu)建體可能需要與包含選擇標(biāo)記如pSV2neo的載體共轉(zhuǎn)染。通過共轉(zhuǎn)染到二氫葉酸還原酶缺陷型中國倉鼠卵巢細(xì)胞系如DG44，借助加入所述表達(dá)載體的DNA，可以檢測表達(dá)UP_11或OM_10多肽的克隆。
通過本領(lǐng)域已知的多種技術(shù)，可以將本發(fā)明的DNA分子、基因或多核苷酸加入到載體中。例如，已經(jīng)證明載體pUC18尤其有價(jià)值。同樣，相關(guān)載體M13mp18和M13mp19可以用于本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，尤其是用于進(jìn)行雙脫氧法測序。
本發(fā)明的表達(dá)載體用作制備一定量UP_11或OM_10多肽編碼DNA本身的方法，以及用作制備所編碼的多肽和肽的方法?？紤]當(dāng)通過重組方法制備本發(fā)明的UP_11或OM_10多肽時(shí)，技術(shù)人員可以使用原核表達(dá)載體或真核表達(dá)載體，例如穿梭系統(tǒng)。然而，因?yàn)樵讼到y(tǒng)通常不能正確加工前體多肽，尤其是所述系統(tǒng)不能正確加工膜結(jié)合真核多肽，并且由于使用本發(fā)明公開的內(nèi)容可以預(yù)期真核UP_11或OM_10多肽，因此技術(shù)人員可能在真核宿主中表達(dá)所述序列。然而，甚至當(dāng)所述DNA區(qū)段編碼真核UP_11或OM_10多肽時(shí)，考慮原核表達(dá)可能具有某些其它應(yīng)用性。因此，本發(fā)明可以與能夠在真核細(xì)胞和原核細(xì)胞之間穿梭的載體結(jié)合使用。所述系統(tǒng)在本文中有描述，允許使用細(xì)菌宿主細(xì)胞和真核宿主細(xì)胞。
當(dāng)希望表達(dá)重組UP_11多肽或重組OM_10多肽并且考慮使用真核宿主時(shí)，最值得使用加入真核生物復(fù)制起點(diǎn)的載體，如質(zhì)粒。此外，為在真核系統(tǒng)中表達(dá)的目的，技術(shù)人員希望將UP_11或OM_10編碼序列置于有效真核啟動子的附近或控制之下，所述有效真核啟動子例如與中國倉鼠卵巢細(xì)胞結(jié)合使用的啟動子。為產(chǎn)生在啟動子控制下的真核或者原核編碼序列，通常需要將所述多肽適當(dāng)翻譯讀框的翻譯起始側(cè)5′末端置于所選啟動子3′或下游約1個(gè)核苷酸到約50個(gè)核苷酸之間。此外，當(dāng)期望真核表達(dá)時(shí)，技術(shù)人員一般希望在包括UP_11或OM_10多肽的轉(zhuǎn)錄單位內(nèi)加入合適聚腺苷酸化位點(diǎn)。
pCMV質(zhì)粒是在本發(fā)明中尤其有用的一系列哺乳動物表達(dá)載體。所述載體主要設(shè)計(jì)用于基本所有的培養(yǎng)細(xì)胞，在SV40轉(zhuǎn)化的猿COS細(xì)胞系中工作尤其出色。pCMV 1、2、3和5載體相互之間在每種質(zhì)粒多接頭區(qū)內(nèi)的某些獨(dú)特限制性位點(diǎn)上有所不同。pCMV 4載體與這4種質(zhì)粒的不同之處是在所述多接頭前的序列內(nèi)包含翻譯增強(qiáng)子。雖然功能上相似的pCMV6b和c載體并不直接來源于pCMV1-5系列載體，但可以從Chiron Corp.(Emeryville，CA)獲得pCMV6b和c載體，所述載體相互之間相同，只是所述多接頭區(qū)的取向相反。
所述pCMV質(zhì)粒的通用組成如下。載體骨架是pTZ18R(Pharmacia)，包含一個(gè)用于產(chǎn)生單鏈DNA的噬菌體f1復(fù)制起點(diǎn)以及一個(gè)氨芐青霉素抗性基因。所述CMV區(qū)由人巨細(xì)胞病毒(Towne株)主要立即早期基因強(qiáng)啟動子調(diào)節(jié)區(qū)的核苷酸-760到+3組成。人生長激素片段(hGH)包含代表該基因序列1533到2157的轉(zhuǎn)錄終止信號和聚腺苷酸化信號。該片段中有一個(gè)Alu中等重復(fù)DNA序列。最后，SV40復(fù)制起點(diǎn)和早期區(qū)啟動子-增強(qiáng)子來源于其中描述的pcD-X質(zhì)粒(HindII到PstI片段)。該片段中啟動子的取向使轉(zhuǎn)錄從CMV/hGH表達(dá)盒開始進(jìn)行。
所述pCMV質(zhì)粒相互之間的區(qū)別在于所述多接頭區(qū)內(nèi)的差異以及所述翻譯增強(qiáng)子存在與否。開始的pCMV1質(zhì)粒已經(jīng)受到累積的修飾，在所述多接頭區(qū)內(nèi)賦予數(shù)量增加的單一限制性位點(diǎn)。為創(chuàng)建pCMV2，破環(huán)pCMV1兩個(gè)EcoRI位點(diǎn)中的一個(gè)。為創(chuàng)建pCMV3，通過缺失從所述SV40區(qū)開始的短區(qū)段(StuI到EcoRI)，修飾pCMV1，如此使得所述多接頭內(nèi)的PstI、SalI和BamHI位點(diǎn)成為單一位點(diǎn)。為創(chuàng)建pCMV4，加入對應(yīng)于從CMV啟動子轉(zhuǎn)錄的mRNA 5′非翻譯區(qū)的DNA合成片段。通過降低多肽合成中對起始因子的要求，所述序列作為翻譯增強(qiáng)子起作用。為創(chuàng)建pCMV5，從pCMV1的SV40原點(diǎn)區(qū)缺失DNA區(qū)段(HpaI到EcoRI)，使得所述起始多接頭內(nèi)的所有位點(diǎn)成為單一位點(diǎn)。
已經(jīng)在猿COS細(xì)胞、小鼠L細(xì)胞、CHO細(xì)胞和HeLa細(xì)胞中成功地表達(dá)了pCMV載體。在幾個(gè)并排比較中，它們在CHO細(xì)胞中的表達(dá)水平比基于SV40的載體高4到9倍。已經(jīng)使用所述pCMV載體表達(dá)LDL受體、核因子1、GSα多肽、多肽磷酸酶、小突觸小泡蛋白、突觸蛋白、胰島素受體、流感血凝素、雄激素受體、固醇26-羥化酶、類固醇17-羥化酶和類固醇21-羥化酶、細(xì)胞色素P-450氧化還原酶、β-腎上腺素能受體、葉酸受體、膽固醇側(cè)鏈切割酶和其它c(diǎn)DNA的宿主。應(yīng)當(dāng)注意到，可以使用這些質(zhì)粒中的SV40啟動子表達(dá)其它基因，例如顯性選擇標(biāo)記。最后，在pCMU的HindIII位點(diǎn)和PstI位點(diǎn)之間的多接頭內(nèi)有ATG序列，可能引起假的翻譯起始。如果可能，在表達(dá)質(zhì)粒中應(yīng)當(dāng)避免該密碼子。
在又一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供用編碼UP_11或OM_10多肽的多核苷酸轉(zhuǎn)化、感染或轉(zhuǎn)染的重組宿主細(xì)胞，以及來自這些轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞。最好用SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO5、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8或SEQ IDNO10的多核苷酸轉(zhuǎn)染本發(fā)明的重組宿主細(xì)胞。用外源多核苷酸如DNA分子轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染細(xì)胞的方法是本領(lǐng)域眾所周知的，包括例如以下技術(shù)磷酸鈣或DEAE-葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、原生質(zhì)體融合、電穿孔、脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、直接顯微注射和腺病毒感染(Sambrook等，1989)。
最廣泛使用的方法是由磷酸鈣或DEAE-葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染。雖然機(jī)制仍然不清楚，但相信轉(zhuǎn)染DNA通過胞吞作用進(jìn)入細(xì)胞胞質(zhì)，然后被轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞核內(nèi)。根據(jù)細(xì)胞類型，在任何一個(gè)時(shí)間可以轉(zhuǎn)染超過90％的培養(yǎng)細(xì)胞群體。因?yàn)橛闪姿徕}或DEAE-葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染的高效率，所述方法是需要外源DNA在大量細(xì)胞內(nèi)瞬時(shí)表達(dá)實(shí)驗(yàn)的可選方法。磷酸鈣介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染也用于建立整合多個(gè)拷貝外源DNA的細(xì)胞系，所述多個(gè)拷貝外源基因通常以頭尾相連的串聯(lián)排列排列在宿主細(xì)胞基因組上。
在原生質(zhì)體融合方法中，將來自攜帶大量目標(biāo)質(zhì)?？截惖募?xì)菌的原生質(zhì)體直接與培養(yǎng)的哺乳動物細(xì)胞混合。細(xì)胞膜融合后(通常借助聚乙二醇)，將所述細(xì)菌的內(nèi)容物傳遞到所述哺乳動物細(xì)胞質(zhì)，然后將所述質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞核內(nèi)。對于轉(zhuǎn)染，原生質(zhì)體融合并不如通常用于瞬時(shí)表達(dá)測定的許多細(xì)胞系那樣有效，但該方法可用于其中DNA胞吞作用無效率的細(xì)胞系。原生質(zhì)體融合通常產(chǎn)生串聯(lián)整合到宿主染色體的多拷貝質(zhì)粒DNA。
將短暫的高電壓電脈沖應(yīng)用于多種哺乳動物細(xì)胞和植物細(xì)胞導(dǎo)致質(zhì)膜上形成納米大小的孔。DNA或者通過這些孔，或者作為伴隨所述孔關(guān)閉的膜成分重新分配的結(jié)果，被直接攝入細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)。電穿孔非常有效，可以用于克隆基因的瞬時(shí)表達(dá)，以及用于建立攜帶整合的多個(gè)拷貝目標(biāo)基因的細(xì)胞系。電穿孔與磷酸鈣介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染和原生質(zhì)體融合不同，經(jīng)常產(chǎn)生攜帶一個(gè)或至少幾個(gè)整合的外源DNA拷貝的細(xì)胞系。
脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染涉及將DNA和RNA封裝入脂質(zhì)體內(nèi)，然后使所述脂質(zhì)體與細(xì)胞膜融合。DNA如何被傳遞到細(xì)胞的機(jī)制還不清楚，但轉(zhuǎn)染效率可以高達(dá)90％。
將DNA分子直接顯微注射到核的好處是DNA不暴露于細(xì)胞區(qū)室如低pH內(nèi)體。因此，顯微注射主要用作建立攜帶整合的多個(gè)拷貝目標(biāo)基因的細(xì)胞系。
應(yīng)用腺病毒作為載體進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染是本領(lǐng)域眾所周知的。已經(jīng)報(bào)道針對各種細(xì)胞的腺病毒載體介導(dǎo)的細(xì)胞轉(zhuǎn)染。
轉(zhuǎn)染細(xì)胞可以是原核細(xì)胞或真核細(xì)胞。本發(fā)明的宿主細(xì)胞最好是真核宿主細(xì)胞。本發(fā)明的重組宿主細(xì)胞可以是COS-1細(xì)胞。如果需要生產(chǎn)人UP_11或OM_10多肽，培養(yǎng)的哺乳動物細(xì)胞或人類細(xì)胞尤其有用。
另一方面，本發(fā)明的重組宿主細(xì)胞是原核宿主細(xì)胞。本發(fā)明的重組宿主細(xì)胞最好是大腸桿菌DH5α株的細(xì)菌細(xì)胞。一般而言，原核細(xì)胞優(yōu)選用于起始克隆本發(fā)明中使用的DNA序列，以及構(gòu)建本發(fā)明中使用的載體。例如，大腸桿菌K12株可能尤其有用。其它可以應(yīng)用的微生物菌株包括大腸桿菌B和大腸桿菌x1976(ATCC第31537號)。當(dāng)然，這些實(shí)例是說明性的，而不是限制性的。
原核細(xì)胞可以應(yīng)用于表達(dá)?？梢允褂蒙衔奶岬降木辏约按竽c桿菌W3110(ATCC第273325號)、芽孢桿菌(bacilli)如枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)或其它腸細(xì)胞科如鼠傷寒沙門氏菌(Salmonellatyphimurium)或粘質(zhì)沙雷氏菌(Serratia marcesans)以及各種假單胞菌。
一般而言，包含來自與宿主細(xì)胞匹配的物種的復(fù)制子和控制序列的質(zhì)粒載體與這些宿主一起使用。所述載體一般攜帶一個(gè)復(fù)制位點(diǎn)以及能夠提供對轉(zhuǎn)化細(xì)胞進(jìn)行表型選擇的標(biāo)記序列。例如，可以使用來自大腸桿菌的質(zhì)粒pBR322轉(zhuǎn)化大腸桿菌。pBR322包含氨芐青霉素抗性基因和四環(huán)素抗性基因，因此提供鑒定轉(zhuǎn)化細(xì)胞的容易方法。所述pBR質(zhì)?；蛘咂渌⑸镔|(zhì)?；蚴删w也必須含有或者經(jīng)修飾后含有用于表達(dá)其本身多肽的微生物能夠使用的啟動子。
在重組DNA構(gòu)建中最通常使用的那些啟動子包括β-內(nèi)酰胺酶(青霉素酶)和乳糖啟動子系統(tǒng)以及色氨酸(TRP)啟動子系統(tǒng)(歐洲申請第EP 0036776號)。雖然這些是最通常使用的啟動子，但已經(jīng)發(fā)現(xiàn)和利用其它微生物啟動子，并且已經(jīng)公開關(guān)于它們核苷酸序列的細(xì)節(jié)，這使得技術(shù)人員能夠?qū)⒐δ苄詥幼訉?dǎo)入質(zhì)粒載體中。
除原核生物外，也可以使用真核微生物如酵母。真核微生物中最通常使用釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiase)或普通的面包酵母，雖然可以容易得到多種其它菌株。為在酵母屬(Saccharomyces)中表達(dá)，通常使用例如質(zhì)粒YRp7。該質(zhì)粒已經(jīng)包含trpI基因，該基因?yàn)椴荒茉谏彼岽嬖谙律L的酵母突變株提供選擇標(biāo)記，所述酵母突變株例如ATCC第44076號或PEP4-1。然后，通過在不存在色氨酸的情況下生長，作為酵母宿主細(xì)胞基因組特征存在的trpI損害提供檢測轉(zhuǎn)化的有效環(huán)境。
酵母載體中合適的啟動子序列包括3-磷酸甘油酸激酶或其它糖酵解酶的啟動子，所述其它糖酵解酶例如烯醇酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、己糖激酶、丙酮酸脫羧酶、磷酸果糖激酶、葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶、3-磷酸甘油酸變位酶、丙酮酸激酶、丙糖磷酸異構(gòu)酶、磷酸葡萄糖異構(gòu)酶和葡糖激酶。在構(gòu)建合適表達(dá)質(zhì)粒時(shí)，也將與這些基因結(jié)合的終止序列導(dǎo)入所述表達(dá)載體內(nèi)需要表達(dá)的序列的下游，提供mRNA的聚腺苷酸化和終止。提供由生長條件控制轉(zhuǎn)錄的額外好處的其它啟動子是下列酶的啟動子區(qū)乙醇脫氫酶2、異細(xì)胞色素C、酸性磷酸酶、與氮代謝有關(guān)的降解酶、上文提到的甘油醛-3-磷酸脫氫酶以及負(fù)責(zé)麥芽糖和半乳糖利用的酶。包含與酵母匹配的啟動子、起點(diǎn)或復(fù)制和終止序列的任何質(zhì)粒載體是合適的。
除微生物外，也可以用來自多細(xì)胞生物的細(xì)胞的培養(yǎng)物作為宿主。原則上，任何所述細(xì)胞培養(yǎng)物都是可使用的，不論所述細(xì)胞培養(yǎng)物是來自脊椎動物細(xì)胞培養(yǎng)物還是來自無脊椎動物細(xì)胞培養(yǎng)物。然而，最感興趣的是脊椎動物細(xì)胞，近些年來，繁殖培養(yǎng)物(組織培養(yǎng)物)中的脊椎動物細(xì)胞已經(jīng)成為常規(guī)操作。所述有用宿主細(xì)胞系的實(shí)例是AtT-20、VERO細(xì)胞和HeLa細(xì)胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞系以及W138細(xì)胞系、BHK細(xì)胞系、COSM6細(xì)胞系、COS-7細(xì)胞系、293細(xì)胞系和MDCK細(xì)胞系。用于所述細(xì)胞的表達(dá)載體一般包括(如果需要)復(fù)制起點(diǎn)、位于需要表達(dá)的基因上游的啟動子、以及任何需要的核糖體結(jié)合位點(diǎn)、RNA剪接位點(diǎn)、聚腺苷酸化位點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄終止序列。
為在哺乳動物細(xì)胞中應(yīng)用，所述表達(dá)載體上的控制功能常常來自病毒材料。例如，通常使用的啟動子來自多瘤病毒、腺病毒2、巨細(xì)胞病毒以及最頻繁使用猿猴病毒40(SV40)。SV40病毒的早期和晚期啟動子尤其有用，因?yàn)榭梢匀菀椎貜乃霾《精@得還包含SV40病毒復(fù)制起點(diǎn)的片段的這兩種啟動子。也可以使用更小或更大的SV40片段，只要其中包括從HindIII位點(diǎn)向病毒復(fù)制起點(diǎn)內(nèi)BglI位點(diǎn)延伸的約250bp序列。此外，技術(shù)人員常常希望并且有可能利用通常與所需基因序列連接的啟動子或控制序列，只要所述控制序列與所述宿主細(xì)胞系統(tǒng)匹配即可。
通過構(gòu)建所述載體使其包括外源起點(diǎn)，可以提供復(fù)制起點(diǎn)，所述外源起點(diǎn)例如可以來自SV40或其它病毒(例如多瘤病毒、腺病毒、VSV、BPV、CMV)來源，或者可以由宿主細(xì)胞染色體復(fù)制機(jī)制提供。假如所述載體整合到宿主細(xì)胞染色體，那么后一種方式常常就足夠了。
在又一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明考慮制備UP_11或OM_10多肽的工藝或方法，所述工藝或方法包括用編碼UP_11或OM_10多肽的多核苷酸轉(zhuǎn)染細(xì)胞，產(chǎn)生轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞；然后在足以表達(dá)所述多肽的生物學(xué)條件下維持所述轉(zhuǎn)化細(xì)胞。所述轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞優(yōu)選是真核細(xì)胞?；蛘?，所述宿主細(xì)胞是原核細(xì)胞。更優(yōu)選所述原核細(xì)胞是大腸桿菌DH5α株細(xì)菌細(xì)胞。甚至更優(yōu)選轉(zhuǎn)染到所述轉(zhuǎn)化細(xì)胞的多核苷酸包含SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO5、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8或SEQ ID NO10的核酸序列。此外，使用上文公開的表達(dá)載體完成轉(zhuǎn)染。
在所述工藝中使用的宿主細(xì)胞能夠表達(dá)功能性重組UP_11或OM_10多肽。優(yōu)選的宿主細(xì)胞是中國倉鼠卵巢細(xì)胞。然而，各種細(xì)胞適用于本發(fā)明的工藝，例如酵母細(xì)胞、人類細(xì)胞系和其它本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的真核細(xì)胞系。
轉(zhuǎn)染后，所述細(xì)胞在足以表達(dá)UP_11或OM_10受體多肽的培養(yǎng)條件下維持一段時(shí)間。培養(yǎng)條件是本領(lǐng)域眾所周知的，包括離子組成和濃度、溫度、pH等。通常，在培養(yǎng)基內(nèi)的培養(yǎng)條件下維持轉(zhuǎn)染細(xì)胞。各種細(xì)胞類型合適的培養(yǎng)基是本領(lǐng)域眾所周知的。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，溫度為約20℃到約50℃，更優(yōu)選約30℃到約40℃，甚至更優(yōu)選約37℃。
pH值優(yōu)選為約6.0到約8.0，更優(yōu)選約6.8到約7.8，最優(yōu)選約7.4。重量摩爾滲透壓濃度優(yōu)選為約200微摩爾每升(mosm/L)到約400mosm/L，更優(yōu)選從約290mosm/L到約310mosm/L。轉(zhuǎn)染和表達(dá)編碼蛋白所需的其它生物學(xué)條件是本領(lǐng)域眾所周知的。
維持轉(zhuǎn)染細(xì)胞達(dá)到足以表達(dá)UP_11或OM_10多肽的一段時(shí)間。合適的時(shí)間尤其依賴于所使用的細(xì)胞類型，并且可以容易地由技術(shù)人員確定。通常維持時(shí)間為約2天到約14天。
從轉(zhuǎn)染細(xì)胞或培養(yǎng)所述細(xì)胞的培養(yǎng)基中回收或收集重組UP_11或OM_10多肽?；厥瞻ǚ蛛x和純化所述UP_11或OM_10多肽。多肽的分離和純化技術(shù)是本領(lǐng)域眾所周知的，包括例如沉淀、過濾、層析、電泳等程序。
E.轉(zhuǎn)基因動物在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及具有體細(xì)胞和生殖細(xì)胞的非人類動物，所述體細(xì)胞和生殖細(xì)胞具有功能被破環(huán)的至少一個(gè)、更優(yōu)選兩個(gè)本發(fā)明內(nèi)源G-多肽偶聯(lián)受體(GPCR)等位基因。因此，本發(fā)明提供具有突變型UP_11或OM_10基因并因此缺乏UP_11或OM_10活性的活動物。對于在野生型對照動物中產(chǎn)生正常量UP_11或OM_10的刺激，這些動物會產(chǎn)生數(shù)量顯著降低的UP_11或OM_10。本發(fā)明的動物可用于例如作為評價(jià)UP_11或OM_10抑制劑的標(biāo)準(zhǔn)對照，或者作為正常人UP_11或OM_10基因的受體，由此創(chuàng)建用于體內(nèi)篩選人UP_11或OM_10抑制劑的模型系統(tǒng)，以及用于鑒定UP_11或OM_10抑制劑治療的疾病狀態(tài)。所述動物也用作研究配體對UP_11或OM_10多肽的影響的對照。
在本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因非人類動物中，最好通過內(nèi)源等位基因以及導(dǎo)入所述動物胚胎干細(xì)胞前體內(nèi)的突變UP_11或OM_10多核苷酸或其部分之間的同源重組，破環(huán)UP_11或OM_10基因。然后允許所述胚胎干細(xì)胞前體發(fā)育，產(chǎn)生UP_11或OM_10基因功能被破環(huán)的動物。本文所用的術(shù)語“轉(zhuǎn)基因動物”是非人類動物，優(yōu)選哺乳動物，更優(yōu)選嚙齒動物如大鼠或小鼠，其中所述動物的一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞包括轉(zhuǎn)基因。轉(zhuǎn)基因動物的其它實(shí)例包括非人類靈長類動物、綿羊、狗、母牛、山羊、雞、兩棲動物等。所述動物可以具有一個(gè)功能被破環(huán)的UP_11或OM_10等位基因(即所述動物可能對于所述突變是雜合的)，或更優(yōu)選所述動物具有功能都被破環(huán)的UP_11或OM_10等位基因(即所述動物對于所述突變是純合的)。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，功能被破環(huán)的UP_11或OM_10等位基因產(chǎn)生這樣的動物與非突變動物相比，所述動物的細(xì)胞中基本上不存在UP_11或OM_10基因表達(dá)產(chǎn)物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可以破環(huán)所述UP_11或OM_10等位基因，以便在所述動物的細(xì)胞中產(chǎn)生改變的(即突變的)UP_11或OM_10基因產(chǎn)物。本發(fā)明優(yōu)選的UP_11或OM_10基因功能被破環(huán)的非人類動物是小鼠。假設(shè)本發(fā)明純合動物中UP_11或OM_10功能基本上完全失活，本發(fā)明雜合動物中UP_11或OM_10功能受到約50％抑制，那么用這些動物作為陽性對照，評價(jià)UP_11或OM_10抑制劑的有效性。例如，在需要測試的UP_11或OM_10抑制劑的存在下，給予野生型動物(即具有未突變UP_11或OM_10基因的動物)正常誘導(dǎo)UP_11或OM_10產(chǎn)生或活性的刺激，然后可以測量所述動物體內(nèi)UP_11或OM_10的產(chǎn)生或活性。然后可以將所述野生型動物中的UP_11或OM_10反應(yīng)與同樣給予UP_11或OM_10刺激的本發(fā)明雜合動物和純合動物中的UP_11或OM_10反應(yīng)進(jìn)行比較，確定所述試驗(yàn)抑制劑最大UP_11或OM_10抑制的百分率。
此外，本發(fā)明的動物用于確定具體疾病狀況是否涉及UP_11或OM_10的作用，以及是否因此能夠用UP_11或OM_10抑制劑進(jìn)行治療。例如，可以嘗試在UP_11或OM_10基因功能被破環(huán)的本發(fā)明動物體內(nèi)誘導(dǎo)疾病狀態(tài)。然后可以確定所述動物對于所述疾病狀況的易感性或抗性。根據(jù)本發(fā)明動物對疾病狀況的抗性，可以鑒定能夠用UP_11或OM_10抑制劑治療的疾病狀況。本發(fā)明的另一方面涉及轉(zhuǎn)基因非人類動物，所述轉(zhuǎn)基因非人類動物具有功能被破環(huán)的內(nèi)源UP_11或OM_10基因，但在其基因組中也攜帶和表達(dá)編碼異源UP_11或OM_10的轉(zhuǎn)基因(即來自另一物種的GPCR)。所述動物最好是小鼠，所述異源UP_11或OM_10是人UP_11或OM_10(例如SEQID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3和SEQ ID NO8)。已經(jīng)用人UP_11或OM_10重新構(gòu)建的本發(fā)明的動物可以用于鑒定體內(nèi)抑制人UP_11或OM_10的試劑。例如，在需要測試的試劑存在或不存在的情況下，可以給予所述動物誘導(dǎo)UP_11或OM_10產(chǎn)生和/或活性的刺激，然后測量所述動物體內(nèi)的UP_11和OM_10反應(yīng)。根據(jù)以下標(biāo)準(zhǔn)鑒定體內(nèi)抑制人UP_11或OM_10的試劑與所述試劑不存在時(shí)的UP_11或OM_10反應(yīng)相比，在所述試劑存在時(shí)UP_11或OM_10反應(yīng)降低。本文所用的“轉(zhuǎn)基因”是整合到細(xì)胞(由所述細(xì)胞發(fā)育成轉(zhuǎn)基因動物)基因組的外源DNA，并且所述外源DNA保留在成熟動物的基因組中，由此指導(dǎo)所述轉(zhuǎn)基因動物體內(nèi)一種或多種細(xì)胞類型或組織中所編碼的基因產(chǎn)物表達(dá)。
本發(fā)明的再一方面涉及用于破環(huán)宿主細(xì)胞內(nèi)UP_11或OM_10基因功能的多核苷酸構(gòu)建體。所述核酸構(gòu)建體包含a)非同源取代部分；b)位于所述非同源取代部分上游的第一個(gè)同源區(qū)，所述第一個(gè)同源區(qū)具有與第一個(gè)UP_11或OM_10基因序列有基本同一性的核苷酸序列；和c)位于所述非同源取代部分下游的第二個(gè)同源區(qū)，所述第二個(gè)同源區(qū)具有與第二個(gè)UP_11或OM_10基因序列有基本同一性的核苷酸序列，所述第二個(gè)UP_11或OM_10基因序列占據(jù)在天然存在的內(nèi)源UP_11或OM_10基因內(nèi)所述第一個(gè)UP_11或OM_10基因序列下游的位置。此外，所述第一個(gè)和第二個(gè)同源區(qū)足夠長，使得當(dāng)將核酸構(gòu)建體導(dǎo)入宿主細(xì)胞時(shí)，在所述核酸分子和宿主細(xì)胞中內(nèi)源UP_11或OM_10基因之間能夠發(fā)生同源重組。本文所用的“同源重組動物”是非人類動物，優(yōu)選哺乳動物，更優(yōu)選小鼠，其中內(nèi)源UP_11或OM_10基因已經(jīng)通過所述內(nèi)源基因與外源DNA分子之間的同源重組而被改變，所述外源DNA分子在所述動物發(fā)育之前導(dǎo)入動物細(xì)胞，例如動物胚胎細(xì)胞。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述非同源取代部分包含一個(gè)陽性選擇表達(dá)盒，最好包括與調(diào)節(jié)元件有效連接的新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述核酸構(gòu)建體也包括在同源區(qū)上游或下游末端的負(fù)選擇表達(dá)盒。優(yōu)選的負(fù)選擇表達(dá)盒包括有效連接調(diào)節(jié)元件的單純皰疹病毒胸苷激酶基因。本發(fā)明的另一方面涉及其中摻入了本發(fā)明核酸構(gòu)建體的重組載體。
本發(fā)明的再一方面涉及宿主細(xì)胞，其中已經(jīng)在所述宿主細(xì)胞中導(dǎo)入了本發(fā)明核酸構(gòu)建體，由此允許所述核酸構(gòu)建體與宿主細(xì)胞內(nèi)源UP_11或OM_10基因之間的同源重組，導(dǎo)致內(nèi)源UP_11或OM_10基因的功能被破環(huán)。所述宿主細(xì)胞可以是正常表達(dá)UP_11或OM_10的哺乳動物細(xì)胞例如人神經(jīng)元，或者是多能細(xì)胞例如小鼠胚胎干細(xì)胞。所述核酸構(gòu)建體已經(jīng)導(dǎo)入其中并且與內(nèi)源UP_11或OM_10基因同源重組的胚胎干細(xì)胞進(jìn)一步發(fā)育，產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因非人類動物，所述動物具有源自所述胚胎干細(xì)胞并因此在它們的基因組中攜帶UP_11或OM_10基因被破環(huán)的細(xì)胞?？梢赃x擇在其種系中攜帶UP_11或OM_10基因被破環(huán)的動物，然后繁育所述動物，產(chǎn)生在所有體細(xì)胞和生殖細(xì)胞中都具有UP_11或OM_10基因被破環(huán)的動物。然后繁育所述小鼠至UP_11或OM_10基因被破壞的純合性。
考慮在一些情況下，可以通過穩(wěn)定導(dǎo)入本文所述的一種或多種天然、合成修飾或突變的UP_11或OM_10多核苷酸組合物，改變本發(fā)明轉(zhuǎn)基因動物的基因組。本文所用的“轉(zhuǎn)基因動物”指任何動物，優(yōu)選非人類哺乳動物(例如小鼠、大鼠、兔、松鼠、倉鼠、兔、豚鼠、豬、微型豬(micro-pig)、prairie、狒狒、松鼠猴和黑猩猩等)、鳥或兩棲動物，其體內(nèi)的一種或多種細(xì)胞包含由于人類的干預(yù)而導(dǎo)入的異源核酸，所述人類干預(yù)例如本領(lǐng)域眾所周知的轉(zhuǎn)基因技術(shù)。借助精細(xì)遺傳操作，例如顯微注射或重組病毒感染，通過將所述核酸導(dǎo)入所述細(xì)胞的前體，直接或間接地將所述核酸導(dǎo)入所述細(xì)胞。術(shù)語遺傳操作不包括經(jīng)典雜交育種或體外受精，而是指引入重組DNA分子?？梢詫⒃摲肿诱系饺旧w內(nèi)，或者該分子可以是在染色體外復(fù)制的DNA。
可以如下產(chǎn)生本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因動物例如通過顯微注射、逆轉(zhuǎn)錄病毒感染，將UP_11或OM_10多肽編碼核酸導(dǎo)入受精卵母細(xì)胞的雄性原核內(nèi)，然后允許所述卵母細(xì)胞發(fā)育成為假孕的雌性代孕動物。可以將SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3或SEQ ID NO8的人UP_11或OM_10多核苷酸序列作為轉(zhuǎn)基因?qū)敕侨祟悇游锏幕蚪M。
此外，根據(jù)與人UP_11或OM_10多核苷酸(上文所述)的雜交，可以分離人UP_11或OM_10基因的非人類同源物，例如小鼠UP_11或OM_10基因，并用所述同源物作為轉(zhuǎn)基因。在所述轉(zhuǎn)基因中也可以包括內(nèi)含子序列和聚腺苷酸化信號，增加所述轉(zhuǎn)基因表達(dá)的效率?？梢詫⒔M織特異性調(diào)節(jié)序列有效連接到UP_11或OM_10轉(zhuǎn)基因，指導(dǎo)UP_11或OM_10多肽在特定細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)。通過胚胎操作和顯微注射產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動物(尤其是例如小鼠等動物)的方法已經(jīng)是本發(fā)明內(nèi)的常規(guī)方法，在例如美國專利第4,736,866號、第4,870,009號和第4,873,191號以及Hogan，1986中有描述。使用同樣的方法產(chǎn)生其它轉(zhuǎn)基因動物。根據(jù)基因組中UP_11或OM_10轉(zhuǎn)基因的存在和/或UP_11或OM_10mRNA在動物組織或細(xì)胞中的表達(dá)，可以鑒定出轉(zhuǎn)基因建立者動物。然后使用轉(zhuǎn)基因建立者動物繁育攜帶所述轉(zhuǎn)基因的其它動物。此外，攜帶編碼UP_11或OM_10多肽的轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因動物可以進(jìn)一步繁育成為攜帶其它轉(zhuǎn)基因的其它轉(zhuǎn)基因動物。
為產(chǎn)生同源重組動物，制備包含UP_11或OM_10基因至少一個(gè)片段的載體，所述片段中已經(jīng)引入缺失、添加或取代，由此改變(例如功能被破環(huán))所述UP_11或OM_10基因。所述UP_11或OM_10基因可以是人類基因(例如來自從人類基因組文庫分離的人類基因組克隆，如SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3或SEQ ID NO8)，但更優(yōu)選是人GPCR基因的非人類同源物(例如SEQ ID NO5、SEQ IDNO6或SEQ ID NO10的鼠多核苷酸)。所述小鼠UP_11或OM_10基因可以用于構(gòu)建適于改變小鼠基因組中內(nèi)源UP_11或OM_10基因的同源重組載體。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，設(shè)計(jì)所述載體，以便當(dāng)發(fā)生同源重組時(shí)，所述內(nèi)源UP_11或OM_10基因功能被破環(huán)(即不再編碼功能性蛋白；也稱為“剔除(knock out)”載體)。
或者，可以設(shè)計(jì)所述載體，以便當(dāng)發(fā)生同源重組時(shí)，所述內(nèi)源UP_11或OM_10基因發(fā)生突變，或者以其它方式被改變，但仍然編碼功能性蛋白(例如可以改變上游調(diào)節(jié)區(qū)，由此改變內(nèi)源UP_11或OM_10多肽的表達(dá))。在同源重組載體中，所述UP_11或OM_10基因被改變的片段在其5′和3′末端兩側(cè)是UP_11或OM_10基因的其它核酸(例如SEQ ID NO1側(cè)翼的非編碼序列是5′核苷酸1-297和3′核苷酸1,654-3,824，SEQ ID NO2的非編碼序列是3′核苷酸1,314-3,456，SEQ ID NO3的非編碼序列是5′核苷酸1-670和3′核苷酸2,027-3,779)，以允許所述載體攜帶的外源UP_11或OM_10基因與胚胎干細(xì)胞的內(nèi)源UP_11或OM_10基因之間發(fā)生同源重組。其它側(cè)翼的UP_11或OM_10核酸具有足夠長度，使得能夠與內(nèi)源基因之間成功地進(jìn)行同源重組。
所述載體內(nèi)一般包括數(shù)千堿基的側(cè)翼DNA(在5′末端和3′末端)(參見例如Thomas和Capecchi，1987，有關(guān)同源重組載體的介紹)。將所述載體導(dǎo)入胚胎干細(xì)胞系(例如通過電穿孔)，然后選擇其中導(dǎo)入的UP_11或OM_10基因與內(nèi)源UP_11或OM_10基因之間發(fā)生同源重組的細(xì)胞(參見例如Li等，1992)。然后將所選細(xì)胞注射到動物(例如小鼠)胚泡，形成聚集嵌合體(參見例如Bradley，1987，第113-152頁)。然后可以將嵌合胚胎植入合適的假孕雌性代孕動物體內(nèi)，繁育所述胚胎至產(chǎn)期?？梢允褂迷谏臣?xì)胞中攜帶同源重組的DNA的后代，通過所述轉(zhuǎn)基因的種系傳遞，繁育其中所有細(xì)胞都包含所述同源重組DNA的動物。構(gòu)建同源重組載體和同源重組動物的方法進(jìn)一步在Bradley，1991和國際申請第WO 90/11354號、第WO 91/01140號、第WO 92/0968號和第WO 93/04169號中有描述。
在又一個(gè)實(shí)施方案中，可以產(chǎn)生非人類轉(zhuǎn)基因動物，所述轉(zhuǎn)基因動物包含允許所述轉(zhuǎn)基因表達(dá)受到調(diào)節(jié)的所選系統(tǒng)。所述系統(tǒng)的一個(gè)實(shí)例是噬菌體PL的cre/loxP重組酶系統(tǒng)。有關(guān)所述cre/loxP重組酶系統(tǒng)的介紹，參見例如Lakso等，1992。重組酶系統(tǒng)的另一個(gè)實(shí)例是釀酒酵母的FLP重組酶系統(tǒng)(O’Gonnan等，1991)。假如使用cre/loxP重組酶系統(tǒng)調(diào)節(jié)所述轉(zhuǎn)基因的表達(dá)，那么需要包含編碼Cre重組酶以及所選蛋白的轉(zhuǎn)基因的動物?？梢酝ㄟ^構(gòu)建“雙”轉(zhuǎn)基因動物提供所述動物，例如通過使兩種轉(zhuǎn)基因動物交配，其中一種動物攜帶編碼所選蛋白的轉(zhuǎn)基因，而另一種動物攜帶編碼重組酶的轉(zhuǎn)基因。
也可以根據(jù)Wilmut等，1997和國際申請第WO 97/07668號和第WO 97/07669號中描述的方法，產(chǎn)生本文描述的非人類轉(zhuǎn)基因動物的克隆。概括地講，可以分離來自轉(zhuǎn)基因動物的細(xì)胞如體細(xì)胞，誘導(dǎo)其離開生長循環(huán)，進(jìn)入G0期。然后例如通過使用電脈沖，使所述休眠細(xì)胞與去核卵母細(xì)胞融合，所述去核卵母細(xì)胞來自分離所述休眠細(xì)胞的同一物種的動物。然后培養(yǎng)所述重新構(gòu)建的卵母細(xì)胞，以便其發(fā)育成為桑椹胚或胚泡，然后轉(zhuǎn)移到假孕的雌性代孕動物體內(nèi)。該雌性假孕動物生出的后代將是分離所述細(xì)胞(例如體細(xì)胞)的動物的克隆。
F.本發(fā)明的應(yīng)用和方法本文描述的核酸分子、多肽、多肽同源物、調(diào)節(jié)劑和抗體可以用于但不限于一種或多種以下方法a)藥物篩選測定；b)診斷分析，尤其是疾病鑒定、等位基因篩選和藥物遺傳學(xué)檢測中的診斷分析；c)治療方法；d)藥物基因組學(xué)(pharmacogenomics)；和e)監(jiān)測臨床試驗(yàn)期間的效應(yīng)。本發(fā)明的UP_11或OM_10多肽可以作為藥物靶，開發(fā)調(diào)節(jié)UP_11或OM_10多肽活性的藥物。本發(fā)明的分離核酸分子可以用于表達(dá)UP_11或OM_10多肽(例如通過宿主細(xì)胞內(nèi)或基因治療應(yīng)用中的重組表達(dá)載體)、檢測UP_11或OM_10mRNA(例如在生物學(xué)樣品中)或UP_11或OM_10基因中的天然存在的或重組產(chǎn)生的遺傳突變、以及調(diào)節(jié)UP_11或OM_10多肽活性，如下文進(jìn)一步描述。此外，所述UP_11或OM_10多肽可以用于篩選調(diào)節(jié)UP_11或OM_10多肽活性的藥物或化合物。此外，本發(fā)明的抗UP_11或OM_10抗體可以用于檢測和分離UP_11或OM_10多肽，尤其是生物學(xué)樣品中存在的UP_11或OM_10多肽片段，以及用于調(diào)節(jié)UP_11或OM_10多肽活性。
藥物篩選測定本發(fā)明提供鑒定化合物或藥劑的方法，所述化合物或藥劑能夠用于治療特征在于(或涉及)UP_11或OM_10核酸不正?；虍惓１磉_(dá)和/或UP_11或OM_10多肽不正?；虍惓；钚缘募膊?。這些方法在本文中也稱為藥物篩選測定，通常包括下述步驟篩選候選/試驗(yàn)化合物或藥劑，鑒定屬于UP_11或OM_10多肽激動劑或拮抗劑的化合物，尤其是篩選與UP_11或OM_10多肽相互作用(例如結(jié)合)的能力、調(diào)節(jié)UP_11或OM_10多肽與靶分子相互作用的能力和/或調(diào)節(jié)UP_11或OM_10核酸表達(dá)和/或UP_11或OM_10多肽活性的能力。
可以使用具有一種或多種這些能力的候選/試驗(yàn)化合物或藥劑作為藥物，治療特征在于UP_11或OM_10核酸不正?；虍惓１磉_(dá)和/或UP_11或OM_10多肽不正常或異?；钚缘募膊?。候選/試驗(yàn)化合物包括例如1)肽，例如可溶性肽，包括Ig尾融合肽，隨機(jī)肽文庫成員，以及由D-構(gòu)型和/或L-構(gòu)型氨基酸組成的組合化學(xué)產(chǎn)生的分子文庫成員；2)磷酸肽(例如隨機(jī)和部分簡并的定向磷酸肽文庫成員，參見例如Songyang等，1993)；3)抗體(例如多克隆抗體、單克隆抗體、人源化抗體、抗獨(dú)特型抗體、嵌合抗體和單鏈抗體以及Fab、F(ab’)2、Fab表達(dá)文庫片段，以及抗體的表位結(jié)合片段)；和4)有機(jī)小分子和無機(jī)小分子(例如從組合文庫和天然產(chǎn)物文庫獲得的分子)。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供篩選與UP_11或OM_10多肽相互作用(例如結(jié)合)的候選/試驗(yàn)化合物的測定。通常，所述測定是基于重組細(xì)胞的測定或無細(xì)胞測定，包括下述步驟例如，在允許候選/試驗(yàn)化合物與UP_11或OM_10多肽或其片段相互作用(例如結(jié)合)而形成復(fù)合物的條件下，使表達(dá)UP_11或OM_10多肽或其生物活性片段的細(xì)胞或者分離的UP_11或OM_10多肽與所述候選/試驗(yàn)化合物混合，然后檢測復(fù)合物的形成，其中所述候選化合物與所述UP_11或OM_10多肽或其片段相互作用(例如結(jié)合)的能力，說明在所述復(fù)合物中存在所述候選化合物。使用競爭性結(jié)合測定，可以檢測所述UP_11或OM_10多肽和所述候選化合物之間復(fù)合物的形成，并且可以使用例如標(biāo)準(zhǔn)免疫測定定量復(fù)合物的形成。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供篩選測定，所述篩選測定鑒定調(diào)節(jié)(例如刺激或抑制)UP_11或OM_10多肽和通常與所述UP_11或OM_10多肽相互作用(很有可能還調(diào)節(jié)UP_11或OM_10多肽活性)的分子(靶分子)之間相互作用的候選/測試化合物。所述靶分子的實(shí)例包括與UP_11或OM_10多肽在同樣信號途徑中的蛋白，例如在認(rèn)知功能信號途徑或涉及UP_11或OM_10多肽活性的途徑中UP_11或OM_10多肽上游(包括活性的刺激劑和抑制劑)或下游起作用的蛋白，例如G蛋白或涉及cAMP或磷脂酰肌醇更新和/或腺苷酸環(huán)化酶或磷脂酶C激活的其它相互作用物(interactor)。通常，所述測定是基于重組細(xì)胞的測定，包括下述步驟將表達(dá)UP_11或OM_10多肽或其生物活性片段的細(xì)胞、UP_11或OM_10多肽靶分子(例如UP_11或OM_10配體)以及候選/試驗(yàn)化合物在不同條件下混合在一起，其中當(dāng)不存在所述候選化合物時(shí)，UP_11或OM_10多肽或其生物活性片段與所述靶分子相互作用(例如結(jié)合)；然后檢測包括UP_11或OM_10多肽和所述靶分子的復(fù)合物形成，或者檢測UP_11或OM_10多肽與所述靶分子之間的相互作用/反應(yīng)。
對復(fù)合物形成的檢測可以包括通過例如測量UP_11或OM_10多肽的誘導(dǎo)效應(yīng)來直接定量所述復(fù)合物。在候選化合物存在下(相對于在不存在候選化合物進(jìn)行檢測時(shí))，UP_11或OM_10多肽與所述靶分子之間相互作用(例如UP_11或OM_10多肽與所述靶分子之間形成復(fù)合物)在統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著改變，如降低，說明UP_11或OM_10多肽與所述靶分子之間相互作用的調(diào)節(jié)(例如刺激或抑制)?？梢允褂美缑庖邷y定，定量UP_11或OM_10多肽與所述靶分子之間復(fù)合物形成的調(diào)節(jié)。
為進(jìn)行無細(xì)胞藥物篩選測定，最好固定化UP_11或OM_10多肽或其靶分子，以利于將復(fù)合物與所述一種或兩種蛋白未形成復(fù)合物的形式分離，以及方便所述測定的自動化。在候選化合物存在或不存在的情況下，UP_11或OM_10多肽與靶分子的相互作用(例如結(jié)合)可以在任何適于盛裝所述反應(yīng)物的容器內(nèi)完成。所述容器的實(shí)例包括微量滴定板、試管和微量離心管。在一個(gè)實(shí)施方案中，可以提供融合蛋白，所述融合物中添加了允許所述蛋白結(jié)合到基質(zhì)上的結(jié)構(gòu)域。例如，可以將谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶/UP_11或OM_10融合蛋白吸收到谷胱甘肽瓊脂糖珠(Sigma Chemical，St.Louis，MO)上或谷胱甘肽衍生的微量滴定板上，然后與細(xì)胞裂解物(例如用35S標(biāo)記的裂解物)和所述候選化合物結(jié)合，所述混合物在有利于形成復(fù)合物的條件(例如鹽和pH是生理?xiàng)l件)下溫育。溫育后，洗滌所述珠，除去任何未結(jié)合的標(biāo)記，然后固定化基質(zhì)，直接測定放射性標(biāo)記，或者解離所述復(fù)合物后測定上清液中的放射性標(biāo)記。或者，可以從基質(zhì)上解離所述復(fù)合物，通過SDS-PAGE分離，使用標(biāo)準(zhǔn)電泳技術(shù)，根據(jù)凝膠定量珠組份內(nèi)發(fā)現(xiàn)的UP_11或OM_10結(jié)合蛋白水平。
在本發(fā)明的藥物篩選測定中也可以使用將蛋白固定在基質(zhì)上的其它技術(shù)。例如，利用生物素和鏈霉抗生物素的綴合，可以固定化UP_11或OM_10多肽或其靶分子。使用本領(lǐng)域眾所周知的技術(shù)(例如生物素化試劑盒，Pierce Chemicals，Rockford，IL)，可以從生物素NHS(N-羥基-琥珀酰亞胺)制備生物素化UP_11或OM_10多肽分子，然后固定化到鏈霉抗生物素包被的96孔板(Pierce Chemical)的孔內(nèi)。或者，可以將與UP_11或OM_10多肽反應(yīng)但并不干擾所述蛋白與其靶分子結(jié)合的抗體衍生化到所述板的孔內(nèi)，然后通過抗體綴合，將UP_11或OM_10多肽捕獲到所述孔內(nèi)。如上所述，在所述板上表現(xiàn)出UP_11或OM_10多肽的孔內(nèi)溫育UP_11或OM_10結(jié)合蛋白和候選化合物的制備物，然后可以定量在所述孔內(nèi)捕獲的復(fù)合物的量。除上文針對GST固定化復(fù)合物敘述的那些方法外，檢測所述復(fù)合物的方法包括使用抗體免疫檢測復(fù)合物，所述抗體與所述UP_11或OM_10多肽靶分子反應(yīng)，或者與UP_11或OM_10多肽反應(yīng)而與所述靶分子競爭；所述方法還包括酶聯(lián)測定，所述測定依賴于檢測與靶分子結(jié)合的酶活性。
在又一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供鑒定能夠用于治療疾病的化合物的方法(例如篩選測定)，所述疾病的特征在于不正常或異常的UP_11或OM_10核酸表達(dá)或UP_11或OM_10多肽活性，或者與不正?；虍惓５腢P_11或OM_10核酸表達(dá)或UP_11或OM_10多肽活性有關(guān)。該方法一般包括下述步驟測定所述化合物或藥劑調(diào)節(jié)UP_11或OM_10核酸表達(dá)或UP_11或OM_10多肽活性的能力，由此鑒定用于治療特征在于不正?；虍惓５腢P_11或OM_10核酸表達(dá)或UP_11或OM_10多肽活性的疾病的化合物。測定所述化合物或藥劑調(diào)節(jié)UP_11或OM_10核酸表達(dá)或UP_11或OM_10多肽活性的能力的方法通常是基于細(xì)胞的測定。例如，對于通過涉及UP_11或OM_10多肽的途徑轉(zhuǎn)導(dǎo)信號的配體，可以在候選化合物存在或不存在的情況下，誘導(dǎo)對所述配體敏感的細(xì)胞過量表達(dá)UP_11或OM_10多肽。
可以鑒定產(chǎn)生依賴于UP_11或OM_10多肽的反應(yīng)(刺激或抑制)在統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著改變的候選化合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，UP_11或OM_10核酸的表達(dá)或者UP_11或OM_10多肽活性在細(xì)胞內(nèi)受到調(diào)節(jié)，然后測量候選化合物對于目標(biāo)讀出(例如cAMP或磷脂酰肌醇更新)的影響。例如可以測定響應(yīng)依賴于UP_11或OM_10多肽的信號級聯(lián)反應(yīng)而受到正調(diào)節(jié)或負(fù)調(diào)節(jié)的基因表達(dá)。在優(yōu)選實(shí)施方案中，所述基因的調(diào)節(jié)區(qū)(例如5′側(cè)翼啟動子和增強(qiáng)子區(qū))有效連接編碼可容易檢測的基因產(chǎn)物的檢測標(biāo)記(例如螢光素酶)。也可以通過例如免疫印跡法，測定UP_11或OM_10多肽或UP_11或OM_10多肽靶分子的磷酸化。
或者，可以利用下述方法鑒定UP_11或OM_10基因表達(dá)調(diào)節(jié)劑(例如可以用于治療特征在于不正?；虍惓P_11或OM_10核酸表達(dá)或UP_11或OM_10多肽活性的疾病的化合物)在所述方法中，使細(xì)胞與候選化合物接觸，然后測定所述細(xì)胞中UP_11或OM_10mRNA或蛋白的表達(dá)。將所述候選化合物存在下UP_11或OM_10mRNA或蛋白的表達(dá)水平與所述候選化合物不存在的情況下UP_11或OM_10mRNA或蛋白表達(dá)水平進(jìn)行比較。然后根據(jù)該比較，可以鑒定作為UP_11或OM_10核酸表達(dá)調(diào)節(jié)劑的候選化合物，所述候選化合物可以用于治療特征在于不正常UP_11或OM_10核酸表達(dá)的疾病。例如，當(dāng)UP_11或OM_10mRNA或蛋白的表達(dá)在所述候選化合物存在的情況下比所述候選化合物不存在的情況下更高(統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著更高)，那么將所述候選化合物鑒定為UP_11或OM_10核酸表達(dá)的刺激物。或者，當(dāng)UP_11或OM_10核酸表達(dá)在所述候選化合物存在的情況下比所述候選化合物不存在的情況下更低(在統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著更低)，那么將所述候選化合物鑒定為UP_11或OM_10核酸表達(dá)的抑制劑。通過本文所述用于檢測UP_11或OM_10mRNA或蛋白的方法，可以測定細(xì)胞內(nèi)的UP_11或OM_10核酸表達(dá)水平。
在本發(fā)明的某些方面，UP_11或OM_10多肽或其部分可以在雙雜交測定或三雜交測定中用作“誘餌蛋白”(參見例如美國專利第5,283,317號；美國依法登記的發(fā)明第H1,892號；Zervos等，1993；Madura等，1993；Bartel等，1993(a)；Iwabuchi等，1993；國際申請第WO94/10300號)，鑒定其它蛋白，這些蛋白與UP_11或OM_10結(jié)合或相互作用(“UP_11或OM_10結(jié)合蛋白”或者“UP_11-或OM_10-bp”)或者涉及UP_11或OM_10活性。所述UP_11或OM_10結(jié)合蛋白也可能涉及UP_11或OM_10多肽或UP_11或OM_10靶的信號傳遞，例如作為UP_11或OM_10介導(dǎo)的信號途徑的下游元件。或者，所述UP_11或OM_10結(jié)合蛋白可以是UP_11或OM_10抑制劑。
因此，在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明考慮測量蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)相互作用，例如UP_11或OM_10和UP_11或OM_10結(jié)合蛋白之間的相互作用。酵母雙雜交系統(tǒng)對于研究蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)相互作用特別有用。可以獲得所述系統(tǒng)的不同形式，用于篩選酵母噬菌粒(Harper等，1993；Elledge等，1991)或者質(zhì)粒(Bartel等，1993(a)，(b)；Finley和Brent，1994)cDNA文庫，以克隆相互作用的蛋白并研究已知的蛋白對。最近，已經(jīng)描述了用于高通量篩選蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)相互作用的特異性抑制劑的雙雜交方法以及一次鑒定蛋白對之間許多不同相互作用的雙雜交篩選(參見美國依法登記的發(fā)明第H1,892號)。
雙雜交系統(tǒng)的成功依賴于以下事實(shí)可以分離許多轉(zhuǎn)錄因子(例如GAL4)的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域以及聚合酶激活結(jié)構(gòu)域，然后再連接以恢復(fù)功能性(Morin等，1993)。概括地講，該測定利用兩種不同的DNA構(gòu)建體。在一種構(gòu)建體中，編碼UP_11或OM_10多肽的基因與編碼已知轉(zhuǎn)錄因子(例如GAL-4)DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的基因融合。在另一種構(gòu)建體中，使來自DNA序列文庫的編碼未鑒定蛋白(“獵物”或“樣品”)的DNA序列與編碼所述已知轉(zhuǎn)錄因子的激活結(jié)構(gòu)域的基因融合。假如所述“誘餌”蛋白和所述“獵物”蛋白能夠在體內(nèi)相互作用，形成依賴于UP_11或依賴于OM_10的復(fù)合物，那么所述轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和激活結(jié)構(gòu)域就能夠相互接近。這種相互接近允許有效連接響應(yīng)所述轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)位點(diǎn)的報(bào)道基因(例如LacZ)的轉(zhuǎn)錄?？梢詸z測所述報(bào)道基因的表達(dá)，然后分離包含所述功能性轉(zhuǎn)錄因子的細(xì)胞集落，用于獲得編碼與UP_11或OM_10多肽相互作用的蛋白的克隆基因。
根據(jù)這些藥物篩選測定鑒定的UP_11或OM_10多肽活性和/或UP_11或OM_10核酸表達(dá)的調(diào)節(jié)劑可以用于治療例如神經(jīng)系統(tǒng)疾病。這些治療方法包括下述步驟例如通過如本文所述的藥用組合物，給予需要所述治療的受治療者(例如患有本文所述疾病的受治療者)所述UP_11或OM_10多肽活性和/或核酸表達(dá)的調(diào)節(jié)劑。
診斷分析本發(fā)明還提供檢測生物學(xué)樣品中存在UP_11或OM_10多肽或UP_11或OM_10核酸分子或其片段的方法。所述方法包括使所述生物學(xué)樣品與能夠檢測UP_11或OM_10多肽或mRNA的化合物或藥劑接觸，以便能夠檢測所述生物學(xué)樣品中存在UP_11或OM_10多肽/編碼核酸分子。用于檢測UP_11或OM_10mRNA的優(yōu)選試劑是能夠與UP_11或OM_10mRNA雜交的已標(biāo)記或可標(biāo)記核酸探針。所述核酸探針可以是例如SEQ ID NO1、SEQ ID NO3、SEQ ID NO5、SEQ ID NO6、SEQ ID NO7、SEQ ID NO8或SEQ ID NO10的全長UP_11或OM_10cDNA或其片段，例如長至少15個(gè)、30個(gè)、50個(gè)、100個(gè)、250個(gè)或500個(gè)核苷酸并且與UP_11或OM_10mRNA足以在嚴(yán)格性條件下特異性雜交的寡核苷酸。用于檢測UP_11或OM_10多肽的優(yōu)選試劑是能夠結(jié)合UP_11或OM_10多肽的已標(biāo)記或可標(biāo)記抗體?？贵w可以是多克隆抗體，或者更優(yōu)選是單克隆抗體。可以使用完整抗體或其片段(例如Fab或F(ab′)2)。術(shù)語“已標(biāo)記或可標(biāo)記”當(dāng)指探針或抗體時(shí)，包括用可檢測物質(zhì)偶聯(lián)(即物理連接)所述探針或抗體以直接標(biāo)記所述探針或抗體，以及利用與另一種直接標(biāo)記的試劑的反應(yīng)性，間接標(biāo)記所述探針或抗體。間接標(biāo)記的實(shí)例包括使用熒光標(biāo)記的第二抗體檢測第一抗體，以及用生物素標(biāo)記DNA探針末端，以便能夠用熒光標(biāo)記的鏈霉抗生物素進(jìn)行檢測。術(shù)語“生物學(xué)樣品”包括從受治療者分離的組織、細(xì)胞和生物學(xué)流體，以及受治療者體內(nèi)存在的組織、細(xì)胞和流體。也就是說，本發(fā)明的檢測方法可以用于檢測體外以及體內(nèi)生物學(xué)樣品內(nèi)的UP_11或OM_10mRNA或蛋白。例如，用于檢測UP_11或OM_10mRNA的體外技術(shù)包括RNA印跡雜交和原位雜交。用于檢測檢測UP_11或OM_10多肽的體外技術(shù)包括酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)、蛋白質(zhì)印跡、免疫沉淀和免疫熒光。或者，可以通過將標(biāo)記抗UP_11或OM_10抗體導(dǎo)入受治療者體內(nèi)，檢測所述受治療者體內(nèi)的UP_11或OM_10多肽。例如，可以用放射性標(biāo)記物標(biāo)記抗體，然后可以通過標(biāo)準(zhǔn)成像技術(shù)檢測受治療者體內(nèi)所述抗體的存在和位置。尤其有用的是檢測在受治療者體內(nèi)表達(dá)的UP_11或OM_10多肽等位基因變異體的方法，以及檢測樣品中UP_11或OM_10多肽片段的方法。
本發(fā)明還包括用于檢測生物學(xué)樣品中存在UP_11或OM_10多肽的試劑盒。例如，所述試劑盒可以包含試劑，例如能夠檢測生物學(xué)樣品中UP_11或OM_10mRNA的已標(biāo)記或可標(biāo)記化合物或藥劑；測定所述樣品中UP_11或OM_10多肽含量的方法；以及將所述樣品中UP_11或OM_10多肽含量與標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行比較的方法。所述化合物或藥劑可以包裝在合適的容器內(nèi)。所述試劑盒還可以包括使用所述試劑盒檢測UP_11或OM_10mRNA或蛋白的說明書。
本發(fā)明的方法也可以用于檢測UP_11或OM_10基因內(nèi)的天然存在的遺傳突變，由此確定攜帶所述突變基因的受治療者是否有患如上文所述特征在于不正?；虍惓P_11或OM_10核酸表達(dá)或UP_11或OM_10多肽活性的疾病的風(fēng)險(xiǎn)。在優(yōu)選實(shí)施方案中，所述方法包括檢測從所述受治療者體內(nèi)獲得的細(xì)胞樣品中是否存在以下情況遺傳突變或者UP_11或OM_10基因的錯(cuò)誤表達(dá)，所述遺傳突變的特征在于影響編碼UP_11或OM_10多肽的基因的完整性的至少一種改變。例如，可以通過確定下面情況中至少一種的存在而檢測所述遺傳突變1)缺失UP_11或OM_10基因的一個(gè)或多個(gè)核苷酸；2)在UP_11或OM_10基因中添加一個(gè)或多個(gè)核苷酸；3)取代UP_11或OM_10基因的一個(gè)或多個(gè)核苷酸；4)UP_11或OM_10基因的染色體重排；5)在UP_11或OM_10基因的信使RNA轉(zhuǎn)錄物水平上的改變，6)UP_11或OM_10基因的異常修飾，例如基因組DNA的甲基化模式，7)存在UP_11或OM_10基因信使RNA轉(zhuǎn)錄物的非野生型剪接模式，8)UP_11或OM_10蛋白的非野生型水平，9)丟失UP_11或OM_10等位基因，和10)UP_11或OM_10蛋白的不適當(dāng)翻譯后修飾。如本文所述，可以使用本領(lǐng)域已知的許多測定技術(shù)，檢測UP_11或OM_10基因內(nèi)的突變。
在某些實(shí)施方案中，對所述突變的檢測包括在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)例如錨定PCR或RACE PCR中應(yīng)用探針/引物(參見例如美國專利第4,683,195號和美國專利第4,683,202號)，或者在連接鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(LCR)中應(yīng)用探針/引物，后者尤其可以用于檢測UP_11或OM_10基因內(nèi)的點(diǎn)突變。該方法可以包括下述步驟從患者中收集細(xì)胞樣品，接著從所述樣品細(xì)胞中分離核酸(例如基因組核酸、mRNA或者它們兩者)，然后在允許UP_11或OM_10基因(如果存在的話)雜交和擴(kuò)增的條件下，使所述核酸樣品與一種或多種與UP_11或OM_10基因特異性雜交的引物接觸，隨后檢測擴(kuò)增產(chǎn)物的存在與否，或者檢測所述擴(kuò)增產(chǎn)物的大小，并將其與對照樣品的長度進(jìn)行比較。
在一個(gè)可替代的實(shí)施方案中，可以通過限制酶切割模式的改變，鑒定來自樣品細(xì)胞的UP_11或OM_10基因中的突變。例如，分離樣品和對照DNA，擴(kuò)增(任選)，用一種或多種限制性內(nèi)切核酸酶消化，然后通過凝膠電泳測定片段長度大小，并進(jìn)行比較。樣品和對照DNA之間片段長度大小的差異說明樣品DNA內(nèi)的突變。此外，可以應(yīng)用序列特異性核酶(參見美國專利第5,498,531號，該專利通過引用全部結(jié)合到本文中)，通過核酶切割位點(diǎn)的發(fā)生或損失，計(jì)數(shù)特異性突變的存在。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，可以使用本領(lǐng)域多種已知測序反應(yīng)中的任何一種直接對UP_11或OM_10基因進(jìn)行測序，并通過將樣品UP_11或OM_10基因的序列與相應(yīng)野生型(對照)序列進(jìn)行比較，檢測突變。測序反應(yīng)的實(shí)例包括那些基于由Maxim和Gilbert(1977)或Sanger(1977)開發(fā)的技術(shù)的測序反應(yīng)。當(dāng)進(jìn)行所述診斷分析時(shí)，可以利用各種自動化測序程序，其中包括通過質(zhì)譜法進(jìn)行測序(參見例如國際申請第WO 94/16101號；Cohen等，1996；和Griffin等1993)。
用于檢測UP_11或OM_10基因中突變的其它方法包括以下方法應(yīng)用對抗切割試劑的保護(hù)，檢測RNA/RNA或RNA/DNA雙鏈體中的錯(cuò)配堿基(Myers等，1985(a)；Cotton等，1988；Saleeba等，1992)，比較突變和野生型核酸的電泳遷移率(Orita等，1989；Cotton，1993；和Hayashi，1992)，以及使用變性梯度凝膠電泳測定突變或野生型片段在包含變性劑梯度的聚丙烯酰胺凝膠中的移動(Myers等，1985)。用于檢測點(diǎn)突變的其它技術(shù)的實(shí)例包括選擇性寡核苷酸雜交、選擇性擴(kuò)增和選擇性引物延伸。
治療方法本發(fā)明的另一方面涉及用于治療患有特征在于不正?；虍惓P_11或OM_10核酸表達(dá)和/或UP_11或OM_10多肽活性(或與其有關(guān))的疾病或紊亂的受治療者(例如人)的方法。這些方法包括給予所述受治療者UP_11或OM_10多肽/基因調(diào)節(jié)劑(激動劑或拮抗劑)以便進(jìn)行治療的步驟。術(shù)語“不正?；虍惓P_11或OM_10多肽表達(dá)”是指非野生型UP_11或OM_10多肽的表達(dá)或UP_11或OM_10多肽表達(dá)的非野生型水平。不正?；虍惓P_11或OM_10多肽活性是指非野生型UP_11或OM_10多肽活性。由于UP_11或OM_10多肽涉及細(xì)胞內(nèi)參與信號傳遞的途徑，因此不正?；虍惓P_11或OM_10多肽活性或表達(dá)干擾由UP_11或OM_10多肽信號傳遞介導(dǎo)的正常功能調(diào)節(jié)。本文所用的術(shù)語“治療”是指減輕或緩解紊亂或疾病的至少一種不良影響或癥狀，所述紊亂或疾病指例如特征在于不正?；虍惓P_11或OM_10多肽活性或UP_11或OM_10核酸表達(dá)(或與其有關(guān))的紊亂或疾病。
本文所用的UP_11或OM_10多肽/基因調(diào)節(jié)劑是能夠調(diào)節(jié)UP_11或OM_10核酸表達(dá)和/或UP_11或OM_10多肽活性的分子。例如，UP_11或OM_10基因或蛋白調(diào)節(jié)劑可以調(diào)節(jié)UP_11或OM_10核酸表達(dá)，例如正調(diào)節(jié)(激活/激動)或負(fù)調(diào)節(jié)(抑制/拮抗)所述表達(dá)。在另一個(gè)實(shí)例中，UP_11或OM_10多肽/基因調(diào)節(jié)劑可以調(diào)節(jié)(例如刺激/激動或者抑制/拮抗)GPCR多肽活性。如果需要通過抑制UP_11或OM_10核酸表達(dá)以治療特征在于不正?；虍惓?非野生型)UP_11或OM_10核酸表達(dá)/UP_11或OM_10多肽活性(或與其有關(guān))的紊亂或疾病，那么UP_11或OM_10調(diào)節(jié)劑可以是如本文所述的反義分子，如核酶?？梢杂糜谝种芔P_11或OM_10核酸表達(dá)的反義分子的實(shí)例包括與SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO5、SEQID NO6、SEQ ID NO8和SEQ ID NO10的5′非翻譯區(qū)片段(也包括起始密碼子)互補(bǔ)的反義分子以及與SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQID NO3、SEQ ID NO5、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8或SEQ ID NO10的3′非翻譯區(qū)片段互補(bǔ)的反義分子。
抑制UP_11或OM_10核酸表達(dá)的UP_11或OM_10調(diào)節(jié)劑也可以是抑制UP_11或OM_10核酸表達(dá)的小分子或其它藥物，例如使用本文所述篩選測定鑒定的小分子或藥物。假如需要通過刺激UP_11或OM_10核酸表達(dá)而治療特征在于不正?；虍惓?非野生型)UP_11或OM_10核酸表達(dá)和/或UP_11或OM_10多肽活性(或與其有關(guān))的疾病或紊亂，那么UP_11或OM_10調(diào)節(jié)劑可以是例如編碼UP_11或OM_10多肽的核酸分子(例如包含與SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO5、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8或SEQ IDNO10的核苷酸序列同源的核苷酸序列的核酸分子)，或者使用本文所述篩選測定所鑒定的刺激UP_11或OM_10核酸表達(dá)的小分子(肽)或藥物。
或者，假如需要通過抑制UP_11或OM_10多肽活性而治療特征在于不正?；虍惓?非野生型)UP_11或OM_10核酸表達(dá)和/或UP_11或OM_10多肽活性(或與其有關(guān))的疾病或紊亂，那么UP_11或OM_10調(diào)節(jié)劑可以是抗UP_11抗體或抗OM_10抗體，或者抑制UP_11或OM_10多肽活性的小分子或其它藥物，例如使用本文所述篩選測定而鑒定的小分子或藥物。假如需要通過刺激UP_11或OM_10多肽活性而治療特征在于不正常或異常(非野生型)UP_11或OM_10核酸表達(dá)和/或UP_11或OM_10多肽活性(或與其有關(guān))的疾病或紊亂，那么UP_11或OM_10調(diào)節(jié)劑可以是活性UP_11或OM_10多肽或其片段(例如具有與SEQ ID NO4、SEQ ID NO7、SEQ ID NO9或SEQ ID NO11的氨基酸序列或其片段同源的氨基酸序列的UP_11或OM_10多肽或其片段)，或者是小分子或其它藥物，例如使用本文所述篩選測定所鑒定的刺激UP_11或OM_10多肽活性的小分子或藥物。
本發(fā)明的其它方面涉及調(diào)節(jié)UP_11或OM_10多肽介導(dǎo)的細(xì)胞活性的方法。這些方法包括下述步驟使所述細(xì)胞與調(diào)節(jié)UP_11或OM_10多肽活性或UP_11或OM_10核酸表達(dá)的試劑(或包括有效量試劑的組合物)接觸，以便UP_11或OM_10多肽介導(dǎo)的細(xì)胞活性相對于正常水平被改變(例如cAMP或磷脂酰肌醇代謝)。本文所用的“GPCR多肽介導(dǎo)的細(xì)胞活性”或“UP_11或OM_10多肽介導(dǎo)的細(xì)胞活性”指正?；虍惓５募?xì)胞活性或功能。UP_11或OM_10多肽介導(dǎo)的細(xì)胞活性的實(shí)例包括磷脂酰肌醇更新、分子(例如蛋白)產(chǎn)生或分泌、收縮、增殖、遷移、分化和細(xì)胞存活。本文所用的術(shù)語“改變的”指細(xì)胞相關(guān)活性的改變，如增加或減少，所述細(xì)胞相關(guān)活性尤其是cAMP或磷脂酰肌醇更新，以及腺苷酸環(huán)化酶或磷脂酶C激活。
在一個(gè)實(shí)施方案中，所述試劑刺激UP_11或OM_10多肽活性或UP_11或OM_10核酸表達(dá)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述試劑抑制UP_11或OM_10多肽活性或UP_11或OM_10核酸表達(dá)。這些調(diào)節(jié)方法可以在體外進(jìn)行(例如所述細(xì)胞與所述試劑一起進(jìn)行培養(yǎng))，或者在體內(nèi)進(jìn)行(例如將所述試劑給予受治療者)。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述調(diào)節(jié)方法在體內(nèi)進(jìn)行，即所述細(xì)胞存在于受治療者如哺乳動物(例如人)體內(nèi)，并且所述受治療者患有特征在于異?；虿徽P_11或OM_10多肽活性或UP_11或OM_10核酸表達(dá)或與其有關(guān)的紊亂或疾病。
在治療方法中使用的核酸分子、蛋白、UP_11或OM_10調(diào)節(jié)劑、化合物等可以加入下文描述的合適藥用組合物，然后通過允許所述分子、蛋白、調(diào)節(jié)劑或化合物等執(zhí)行其既定功能的途徑將其給予所述受治療者。
UP_11或OM_10多核苷酸表達(dá)和/或UP_11或OM_10多肽活性的調(diào)節(jié)劑可以用于治療各種疾病或紊亂，所述疾病或紊亂包括但不限于心肺系統(tǒng)，如急性心力衰竭、低血壓、高血壓、心絞痛、心肌梗塞等；胃腸系統(tǒng)；中樞神經(jīng)系統(tǒng)；腎??；肝??；過度增生性疾病，例如癌癥和牛皮癬；細(xì)胞凋亡疾?。惶弁?；子宮內(nèi)膜異位；厭食；易餓??；哮喘；骨質(zhì)疏松；神經(jīng)精神病如精神分裂癥、譫妄、雙相性精神病、抑郁、焦慮、心理失衡；尿潴留；潰瘍；變態(tài)反應(yīng)；良性前列腺增生；和運(yùn)動障礙，如亨庭頓舞蹈病(Huntington′s disease)或圖雷特綜合征(Tourett′s syndrome)。
涉及腦的疾病包括但不限于涉及神經(jīng)元的疾病，涉及神經(jīng)膠質(zhì)(例如星形膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞、室管膜細(xì)胞和小神經(jīng)膠質(zhì))的疾??；腦水腫、顱內(nèi)壓升高和疝形成、以及腦水腫；畸形和發(fā)育性疾病，例如神經(jīng)管缺陷、前腦異常、后窩異常、以及脊髓空洞癥和脊髓積水；圍產(chǎn)期腦損傷；腦血管疾病，例如那些與低氧、局部缺血和梗塞有關(guān)的疾病，包括低血壓、血流灌注不足、以及低血流狀態(tài)——全腦局部缺血和病灶性腦局部缺血——由于局部血流供應(yīng)引起的梗塞、顱內(nèi)出血，包括大腦內(nèi)(實(shí)質(zhì)內(nèi))出血、蛛網(wǎng)膜下出血和破裂的顱內(nèi)小動脈瘤，以及脈管畸形、高血壓性腦血管疾病，包括腔隙梗塞、裂隙出血和高血壓性腦病；感染，例如急性腦膜炎，包括急性化膿性(細(xì)菌性)腦膜炎和急性無菌性(病毒性)腦膜炎、急性病灶性化膿性感染，包括腦膿腫、硬膜下積膿和硬膜外膿腫，慢性細(xì)菌性腦膜腦炎，包括結(jié)核和分支桿菌病、神經(jīng)梅毒和神經(jīng)疏螺旋體病(萊姆病)、病毒性腦膜腦炎，包括節(jié)肢動物傳(蟲媒)病毒性腦炎，1型單純皰疹病毒、2型單純皰疹病毒、水痘-帶狀皰疹病毒(帶狀皰疹)、巨細(xì)胞病毒、脊髓灰質(zhì)炎、狂犬病和1型人免疫缺陷病毒，包括FHV-1腦膜腦炎(亞急性腦炎)、空泡脊髓病、AIDS相關(guān)肌病、外周神經(jīng)病以及兒童AIDS、進(jìn)行性多病灶性腦白質(zhì)病、亞急性硬化性全腦炎、真菌性腦膜腦炎、其它神經(jīng)系統(tǒng)的傳染?。豢蓚鞑サ暮＞d狀腦病(朊病毒病)；脫髓鞘病，包括多發(fā)性硬化、多發(fā)性硬化變種、急性彌散性腦脊髓炎和急性壞死性出血性腦脊髓炎，以及其它伴有脫髓鞘的疾?。蛔冃孕约膊?，例如影響大腦皮質(zhì)的變性性疾病，包括早老性癡呆和皮克病，基底神經(jīng)節(jié)和腦干的變性性疾病，包括帕金森神經(jīng)功能障礙、特發(fā)性帕金森病(震顫性麻痹)、進(jìn)行性核上麻痹、皮質(zhì)基底變性、多系統(tǒng)萎縮，包括紋狀體黑質(zhì)變性、夏-德雷格綜合征和橄欖體腦橋小腦萎縮，以及亨廷頓舞蹈病；脊髓小腦變性，包括脊髓小腦共濟(jì)失調(diào)，包括弗里德賴希共濟(jì)失調(diào)和共濟(jì)失調(diào)-毛細(xì)管擴(kuò)張；影響運(yùn)動神經(jīng)元的變性性疾病，包括肌萎縮性側(cè)索硬化(運(yùn)動神經(jīng)元病)、延髓脊髓萎縮(肯尼迪綜合征)；和脊髓肌肉萎縮；代謝的先天錯(cuò)誤，例如腦白質(zhì)營養(yǎng)不良，包括克拉貝病、異染性腦白質(zhì)營養(yǎng)不良、腎上腺腦白質(zhì)營養(yǎng)不良、Elizaeus-Merzbacher病和卡納范病、線粒體性腦肌病，包括利氏病和其它線粒體性腦肌??；中毒性和獲得性代謝病，包括維生素缺乏癥，如硫胺素(維生素B1)缺乏癥和維生素B12缺乏癥、代謝紊亂的神經(jīng)后遺癥，包括低血糖、高血糖和肝性腦病、中毒性疾病，包括一氧化碳、甲醇、乙醇和放射性中毒性疾病，包括氨甲蝶呤與放射組合誘導(dǎo)的損傷；腫瘤，例如神經(jīng)膠質(zhì)瘤，包括星形細(xì)胞瘤，包括原纖維性(彌散性)星形細(xì)胞瘤和多形成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、纖維性星形細(xì)胞瘤、多形黃色星形細(xì)胞瘤和腦干神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤、少突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤和室管膜瘤以及相關(guān)室旁質(zhì)損害、神經(jīng)元腫瘤、分化不足的腫瘤，包括成神經(jīng)管細(xì)胞瘤、其它實(shí)質(zhì)腫瘤，包括原發(fā)性腦淋巴瘤、生殖細(xì)胞瘤和松果體實(shí)質(zhì)腫瘤、腦脊髓瘤、轉(zhuǎn)移性腫瘤、副腫瘤性綜合征、外周神經(jīng)鞘腫瘤，包括神經(jīng)鞘瘤、纖維神經(jīng)瘤和惡性外周神經(jīng)鞘腫瘤(惡性神經(jīng)鞘瘤)、神經(jīng)皮膚綜合征(斑痣性錯(cuò)構(gòu)瘤病)，包括神經(jīng)纖維瘤病，包括1型神經(jīng)纖維瘤病(NF1)和2型神經(jīng)纖維瘤病(NF2)、結(jié)節(jié)性腦硬化和Von Hippel-Lindau病，以及神經(jīng)精神病，例如精神分裂癥、躁郁癥、抑郁癥、焦慮和驚恐性障礙。
藥物基因組學(xué)(Pharmacogenomics)可以將試驗(yàn)/候選化合物或者通過如本文描述的篩選測定所鑒定的對UP_11或OM_10多肽活性(例如UP_11或OM_10基因表達(dá))有刺激或抑制作用的調(diào)節(jié)劑給予個(gè)體，以治療(預(yù)防性治療或治療性治療)與不正常UP_11或OM_10多肽活性有關(guān)的疾病(例如神經(jīng)疾病)。結(jié)合這樣的治療，可以考慮所述個(gè)體的藥物基因組學(xué)(即對個(gè)體基因型與該個(gè)體對外源化合物或藥物的反應(yīng)之間關(guān)系的研究)。治療藥物代謝的差異通過改變藥理上有活性的藥物的劑量和血液濃度之間的關(guān)系，可能導(dǎo)致嚴(yán)重毒性或治療失敗。因此，個(gè)體的藥物基因組學(xué)允許根據(jù)所述個(gè)體的基因型，選擇用于預(yù)防性或治療性治療的有效化合物(例如藥物)。所述藥物基因組學(xué)可以進(jìn)一步用于確定合適的劑量和治療方案。因此，可以確定個(gè)體內(nèi)的UP_11或OM_10多肽活性、UP_11或OM_10核酸表達(dá)或UP_11或OM_10基因突變程度，由此選擇用于治療性或預(yù)防性治療所述個(gè)體的合適化合物。
藥物基因組學(xué)涉及對藥物反應(yīng)時(shí)由于受影響病人中的藥物處置和異常作用改變所致的臨床顯著性遺傳變異。參見例如Eichelbaum，1996和Linder，1997。一般而言，可以區(qū)分兩種類型的藥物遺傳學(xué)病癥。遺傳病癥作為單因素遺傳，改變了藥物對機(jī)體的作用方式(藥物作用改變)；或者遺傳病癥作為單因素遺傳，改變了機(jī)體對藥物的作用方式(藥物代謝改變)。這些藥物遺傳學(xué)病癥可以或者作為罕見缺陷發(fā)生或者作為多態(tài)性發(fā)生。例如，葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺乏癥(GOD)是常見的遺傳性酶病，其中主要臨床并發(fā)癥是在攝入氧化劑藥物(抗瘧疾藥、磺胺類藥、鎮(zhèn)痛藥、硝基呋喃類藥)和消耗蠶豆后的溶血作用。
作為示例性的實(shí)施方案，藥物代謝酶的活性是藥物作用強(qiáng)度和持續(xù)時(shí)間的主要決定因素。藥物代謝酶(例如N-乙酰轉(zhuǎn)移酶2(NAT2)和細(xì)胞色素P450酶CYP2136和CYP2C19)遺傳多態(tài)性的發(fā)現(xiàn)，解釋了為什么一些病人攝取藥物的標(biāo)準(zhǔn)安全劑量后沒有獲得預(yù)期的藥物效應(yīng)，或者顯示過分的藥物反應(yīng)和嚴(yán)重毒性。
這些多態(tài)性在群體中表現(xiàn)為兩種表型，即強(qiáng)代謝者(extensivemetabolizer，EM)和弱代謝者(poor metabolizer，PM)。PM的流行在不同群體中是不同的。例如，編碼CYP2136的基因具有高度多態(tài)性，已經(jīng)在PM中鑒定出幾種突變，都導(dǎo)致缺失功能性CYP2D6。CYP2136和CYP2C19的弱代謝者當(dāng)接受標(biāo)準(zhǔn)劑量時(shí)，非常普遍地有過分藥物反應(yīng)和副作用的經(jīng)歷。
假如代謝物是活性治療部分，那么PM顯示沒有治療反應(yīng)，例如可待因通過其CYP2136形成的代謝物嗎啡而介導(dǎo)的鎮(zhèn)痛效應(yīng)。另一個(gè)極端是所謂極度快速代謝者，他們對標(biāo)準(zhǔn)劑量沒有反應(yīng)。最近，已經(jīng)鑒定極度快速代謝的分子基礎(chǔ)是由于CYP2D6基因擴(kuò)增。
因此，可以確定個(gè)體內(nèi)的UP_11或OM_10多肽活性、UP_11或OM_10核酸表達(dá)或UP_11或OM_10基因的突變程度，由此選擇用于治療性或預(yù)防性治療受治療者的合適藥劑。此外，可以進(jìn)行藥物遺傳學(xué)研究，通過鑒定編碼藥物代謝酶的多態(tài)性等位基因的基因型，從而鑒定受治療者的藥物反應(yīng)性表型。當(dāng)用UP_11或OM_10調(diào)節(jié)劑治療受治療者時(shí)，將這方面的知識應(yīng)用于劑量或藥物選擇，能夠避免副反應(yīng)或治療失敗，并因此增強(qiáng)治療或預(yù)防功效，所述UP_11或OM_10調(diào)節(jié)劑例如通過本文所述其中一種示例性篩選測定而鑒定的調(diào)節(jié)劑。
在臨床試驗(yàn)期間監(jiān)測效應(yīng)監(jiān)測化合物(例如藥物)相應(yīng)UP_11或OM_10多肽/基因表達(dá)或活性的影響不僅可以應(yīng)用于基本藥物篩選，而且可以應(yīng)用于臨床試驗(yàn)。例如，在對表現(xiàn)UP_11或OM_10基因表達(dá)、蛋白水平降低或UP_11或OM_10多肽活性受到負(fù)調(diào)節(jié)的受治療者的臨床試驗(yàn)中，可以監(jiān)測通過本文所述篩選測定確定的試劑對于增加UP_11或OM_10基因表達(dá)、蛋白水平或正調(diào)節(jié)UP_11或OM_10活性的有效性?；蛘撸趯Ρ憩F(xiàn)UP_11或OM_10基因表達(dá)、蛋白水平升高或UP_11或OM_10多肽活性受到正調(diào)節(jié)的受治療者的臨床試驗(yàn)中，可以監(jiān)測通過篩選測定確定的試劑對于降低UP_11或OM_10基因表達(dá)、蛋白水平或負(fù)調(diào)節(jié)UP_11或OM_10活性的有效性。在所述臨床試驗(yàn)中，UP_11或OM_10多肽以及優(yōu)選其它涉及例如神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)疾病的基因的表達(dá)或活性可以用作特定細(xì)胞對配體反應(yīng)性的“讀出”或標(biāo)記。
作為非限制性的實(shí)例，可以鑒定用調(diào)節(jié)UP_11或OM_10多肽/基因活性的化合物(例如藥物或小分子，在如本文所述的篩選測定中鑒定)治療時(shí)細(xì)胞內(nèi)受到調(diào)節(jié)的基因，其中包括UP_11或OM_10基因。因此，為了在例如臨床試驗(yàn)中研究化合物對CNS疾病的作用，可以分離細(xì)胞，制備RNA，分析UP_11或OM_10基因以及其它涉及所述疾病的基因的表達(dá)水平?？梢匀缦露炕虮磉_(dá)的水平(即基因表述模式)通過如本文所述的RNA印跡分析或RT-PCR，或者通過本文描述的其中一種方法測量產(chǎn)生的蛋白量，或者通過測量UP_11或OM_10多肽或其它基因的活性水平。用這種方法，所述基因表達(dá)模式可以作為標(biāo)記，說明所述細(xì)胞對所述化合物的生理反應(yīng)。因此，可以確定治療前和用所述化合物治療所述個(gè)體過程中不同時(shí)間點(diǎn)的該反應(yīng)狀態(tài)。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明提供監(jiān)測用化合物(例如用本文所述篩選測定鑒定的激動劑、拮抗劑、肽模擬物(peptidomimetic)、蛋白、肽、核酸、小分子或其它藥物候選物)治療受治療者的有效性的方法，所述方法包括下述步驟(i)給予所述化合物前從受治療者獲取給藥前樣品；(ii)檢測所述給藥前樣品中UP_11或OM_10多肽、mRNA或基因組DNA的表達(dá)水平；(iii)從所述受治療者獲取一個(gè)或多個(gè)給藥后樣品；(iv)檢測所述給藥后樣品中的UP_11或OM_10多肽、mRNA或基因組DNA表達(dá)水平或活性；(v)將給藥前樣品中UP_11或OM_10多肽、mRNA或基因組DNA的表達(dá)水平或活性與一種或多種給藥后樣品中UP_11或OM_10多肽、mRNA或基因組DNA的表達(dá)水平或活性進(jìn)行比較；然后(vi)由此改變將所述化合物給予所述受治療者的給藥量。例如，可能希望增加所述化合物的給藥量，以增加UP_11或OM_10多肽/基因表達(dá)或活性達(dá)到比檢測值更高的水平，即增加所述藥劑的有效性。
或者，可能希望減少所述藥劑的給藥量，以降低UP_11或OM_10表達(dá)或活性到比檢測值更低的水平，即降低所述化合物的有效性。
藥用組合物本發(fā)明的UP_11或OM_10核酸分子、UP_11或OM_10多肽(尤其是UP_11或OM_10的片段)、UP_11或OM_10多肽調(diào)節(jié)劑以及抗UP_11或OM_10抗體(在本文也稱為“活性化合物”)可以加入適于給予受治療者(例如人)的藥用組合物。所述組合物通常包括所述核酸分子、蛋白、調(diào)節(jié)劑或抗體以及藥學(xué)上可接受的載體。本文所用的術(shù)語“藥學(xué)上可接受的載體”包括與給藥相適應(yīng)的任何和所有溶劑、分散介質(zhì)、包衣、抗細(xì)菌劑和抗真菌劑、等滲劑和吸收延遲劑等。所述介質(zhì)和試劑用作藥學(xué)活性物質(zhì)的應(yīng)用是本領(lǐng)域眾所周知的。除了與所述活性化合物不相適應(yīng)的任何常規(guī)介質(zhì)或試劑外，所述介質(zhì)可以用于本發(fā)明的組合物。在所述組合物中也可以加入輔助的活性化合物。
將本發(fā)明的藥用組合物配制成適合它的計(jì)劃給藥途徑。給藥途徑的實(shí)例包括胃腸外給藥(例如靜脈內(nèi)給藥、皮內(nèi)給藥、皮下給藥)、經(jīng)口給藥(例如吸入給藥)、透皮給藥(局部給藥)、經(jīng)粘膜給藥和直腸給藥。對于胃腸外、皮內(nèi)或皮下應(yīng)用所用的溶液劑或混懸劑可以包括以下組分無菌稀釋劑例如注射用水、鹽溶液、固定油、聚乙二醇、甘油；丙二醇或其它合成溶劑；抗細(xì)菌劑例如苯甲醇或?qū)αu基苯甲酸甲酯；抗氧化劑例如抗壞血酸或亞硫酸氫鈉；螯合劑例如乙二胺四乙酸；緩沖劑例如乙酸鹽、檸檬酸鹽或磷酸鹽以及用于調(diào)節(jié)張力的試劑例如氯化鈉或葡萄糖。pH可以用酸或堿例如鹽酸或氫氧化鈉進(jìn)行調(diào)節(jié)?？梢詫⑽改c外制劑裝入由玻璃或塑料制成的安瓿、一次性注射器或多劑量管形瓶中。
適合用于注射的藥用組合物包括無菌水溶液(就水溶性而論)或者用于臨時(shí)制備無菌注射液或分散劑的分散劑和無菌粉針劑。對于靜脈內(nèi)給藥，合適的載體包括生理鹽水、抑菌水、Cremophor ELTM(BASF，Parsippany，NJ)或磷酸緩沖鹽溶液(PBS)，在所有情況下，注射用組合物應(yīng)該是無菌的并且應(yīng)該是易于注射的液體。所述組合物在生產(chǎn)和儲藏條件下必須是穩(wěn)定的并且必須防止微生物例如細(xì)菌和真菌的污染作用。載體可以是溶劑或分散介質(zhì)，包括例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液態(tài)聚乙二醇等)及它們的合適混合物。可以例如通過利用包衣劑例如卵磷脂，就分散劑而論，通過保持所需粒度以及通過利用表面活性劑，來維持適當(dāng)?shù)牧鲃有?。通過各種抗細(xì)菌劑和抗真菌劑例如對羥基苯甲酸酯、三氯叔丁醇、苯酚、抗壞血酸、硫柳汞等等，可以實(shí)現(xiàn)防止微生物的作用。在許多情況下，在所述組合物中最好是包括等滲劑例如糖類、多羥基醇例如甘露醇、山梨醇、氯化鈉。通過在所述組合物中包括延遲吸收的試劑例如一硬脂酸鋁和明膠，可以使所述注射用組合物的吸收延長。
通過將所述活性化合物(例如UP_11或OM_10多肽或抗UP_11或OM_10抗體)以所需量摻入到具有一種以上列舉的組分或以上列舉的組分的組合的合適溶劑中，必要時(shí)接著進(jìn)行過濾除菌，可以制備無菌注射液。一般而言，通過將所述活性化合物摻入到含有基本分散介質(zhì)和所需其它來自以上列舉的組分的無菌溶媒中，制備分散劑。就用于制備無菌注射液的無菌粉針劑而論，優(yōu)選的制備方法是真空干燥和冷凍干燥，得到所述有效成分加上它們的任何額外所需來自先前過濾除菌溶液的組分的粉針劑。
口服組合物一般包括惰性稀釋劑或可食用載體。可以將其裝入明膠膠囊劑中或者壓成片劑。為了經(jīng)口治療性給藥，所述活性化合物可以與賦形劑一起摻入并且以片劑、錠劑或膠囊劑使用?？诜M合物也可采用可用作漱口劑的液體載體來制備，其中所述液體載體中的所述化合物經(jīng)口給予，漱口后吐出或者吞下。可以包括藥學(xué)上相容的粘合劑和/或輔料作為所述組合物的一部分。所述片劑、丸劑、膠囊劑、錠劑等可以含有任一下述組分或相似性質(zhì)的化合物粘合劑例如微晶纖維素、西黃蓍膠或明膠；賦形劑例如淀粉或乳糖、崩解劑例如藻酸、羧甲基淀粉鈉(Primogel)或玉米淀粉；潤滑劑例如硬脂酸鎂或氫化植物油；助流劑例如膠態(tài)二氧化硅；甜味劑例如蔗糖或糖精；或矯味劑例如歐薄荷、水楊酸甲酯或橙皮矯味劑。
對于吸入給藥，用裝有合適拋射劑如二氧化碳等氣體的加壓容器或分配器或者噴霧器以氣霧劑噴霧形式給予所述化合物。系統(tǒng)給藥也可以是通過經(jīng)粘膜或透皮方式。對于經(jīng)粘膜給藥或透皮給藥，在所述制劑中使用適合穿過屏障的滲透劑。一般而言，這樣的滲透劑是本領(lǐng)域已知的，并且對于經(jīng)粘膜給藥，包括例如去垢劑、膽鹽和夫西地酸衍生物。可以通過應(yīng)用鼻噴霧劑或栓劑完成經(jīng)粘膜給藥。對于透皮給藥，將所述活性化合物配制成本領(lǐng)域公知的軟膏劑、油膏劑、凝膠劑或乳膏劑。
所述化合物也可以制備成栓劑形式(例如用常規(guī)栓劑基質(zhì)例如可可脂和其它甘油酯)或用于直腸給藥的直腸灌腸劑。
在一個(gè)實(shí)施方案中，所述活性化合物同保護(hù)所述化合物抵抗從機(jī)體快速消除的載體一起制備，例如控釋制劑，包括植入片和微囊化傳遞系統(tǒng)。
可以使用生物可降解的生物相容的聚合物，例如乙烯乙酸乙烯、聚酐類、聚乙醇酸、膠原蛋白、聚原酸酯和聚乳酸。這類制劑的制備方法對于本領(lǐng)域技術(shù)人員將會是顯而易見的。所述材料也可以在市場上從例如Alza Corporation和Nova Pharmaceuticals，Inc.獲得。脂質(zhì)體混懸劑(包括用抗病毒抗原的單克隆抗體靶向受感染細(xì)胞的脂質(zhì)體)也可以用作藥學(xué)上可接受的載體?？梢园凑毡绢I(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法，例如在美國專利第4,522,811號中描述的方法，制備這些制劑，所述專利通過引用全部結(jié)合到本文中。
尤其有利的是配制易于給藥和劑量均勻性的劑量單位形式的口服或胃腸外組合物。本文所用的劑量單位形式包括適合作為待治療患者的單元?jiǎng)┝康奈锢砩戏蛛x的單位；計(jì)算每個(gè)單位含有預(yù)定量的活性化合物并結(jié)合所需的藥用載體產(chǎn)生所需的治療效果。本發(fā)明的劑量單位形式的技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)取決于和直接取決于所述活性化合物的獨(dú)特特征以及待達(dá)到的特定療效和用于治療個(gè)體的這種活性化合物的所屬領(lǐng)域的固有限制。
可以將本發(fā)明的核酸分子插入到載體中并且將其用作基因治療載體?？梢酝ㄟ^例如靜脈內(nèi)注射、局部給藥(參見美國專利5,328,470)或立體定位(stereotatic)注射(參見例如Chen等，1994)，將基因治療載體給予患者。所述基因治療載體的藥物制劑可包括基因治療載體的可接受的稀釋劑，或者可以包括其中包埋基因傳遞載體的緩釋基質(zhì)。另一方面，在可以從重組細(xì)胞完整地產(chǎn)生完全基因傳遞載體例如逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的情況下，所述藥物制劑可以包括一種或多種產(chǎn)生所述基因傳遞系統(tǒng)的細(xì)胞。所述藥用組合物可以包括在容器、包裝或分配器中并且附有給藥說明書。
G.部分UP_11或OM_10序列的應(yīng)用本文鑒定的所述cDNA序列的片段(及相應(yīng)的完整基因序列)可以以多種方式用作多核苷酸試劑。例如，這些序列可以用于(a)將它們各自的基因作圖到染色體上；并因此定位與遺傳疾病有關(guān)的基因區(qū)；(b)由小量生物學(xué)樣品鑒定個(gè)體(組織分型)；和(c)協(xié)助對生物學(xué)樣品的法醫(yī)鑒定。這些應(yīng)用在下面的部分描述。
染色體作圖把UP_11或OM_10序列作圖到染色體上是將這些序列與疾病相關(guān)基因相聯(lián)系的重要的第一步。UP_11序列作圖到染色體1p11，OM_10序列作圖到染色體Xq27。然后通過連鎖分析(物理相鄰基因的共遺傳)，鑒定作圖到同一染色體區(qū)上的基因與疾病之間的關(guān)系。
此外，可以鑒定受到和未受到UP_11或OM_10基因相關(guān)疾病影響的個(gè)體之間在DNA序列上的差異。假如在一些或所有受影響個(gè)體內(nèi)觀察到一個(gè)突變，而在任何未受影響個(gè)體內(nèi)沒有觀察到所述突變，那么所述突變有可能是該特定疾病的病因。受影響個(gè)體與未受影響個(gè)體之間的比較總的來講涉及首先尋找染色體內(nèi)的結(jié)構(gòu)改變，例如在染色體伸展上可見或可以使用基于該DNA序列的PCR檢測到的缺失或易位。最后，對幾個(gè)個(gè)體進(jìn)行完全基因測序，證實(shí)突變的存在，并將突變與多態(tài)性區(qū)分開。
實(shí)施例使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)進(jìn)行下面的實(shí)施例，所述標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)除了詳細(xì)描述的以外，都是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知和常規(guī)的技術(shù)。下面的實(shí)施例是為舉例說明的目的提出，不應(yīng)當(dāng)以任何方式理解為限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例1鑒定人UP_11和OM_10多核苷酸序列使用人5-HT6受體序列(登錄號L41147)，對Genbank的高通量基因組序列(HTGS)部分和Celera人類基因組數(shù)據(jù)庫進(jìn)行TBLASTN(Altschul等，1997)搜索，以鑒定新型GPCR樣基因。解析所得HSP，組裝，然后使用BLASTP對完整的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫再次進(jìn)行搜索。所述第二次BLAST搜索用于鑒定新型編碼GPCR的基因組序列。進(jìn)一步使用Genscan(Burge和Karlin，1997)分析新型序列，用BLAST同源性預(yù)測推定的新型GPCR。使用所述預(yù)測的人類序列，設(shè)計(jì)在獲取人UP_11或OM_10物理克隆時(shí)使用的寡核苷酸引物。
使用預(yù)測的人UP_11和OM_10序列，對Celera小鼠基因組數(shù)據(jù)庫也進(jìn)行BLAST搜索。使用Sequencher(GeneCodes)組裝與UP_11或OM_10有高度相似性的Celera小鼠片段，使用Genscan預(yù)測小鼠可讀框。
如下所述，從cDNA文庫中分離cDNA克隆(人UP_11分離物179(SEQ ID NO1)、人UP_11分離物200(SEQ ID NO2)和人UP_11分離物30(SEQ ID NO3)；小鼠mUP_11分離物67.1(SEQ ID NO5)和小鼠mUP_11分離物52.1(SEQ ID NO6)；人OM_10(SEQ ID NO8)和小鼠mOM_10(SEQ ID NO10))。
實(shí)施例2用于克隆UP_11和OM_10的方法文庫構(gòu)建使用Clontech PolyA RNA(分別是人大腦、海馬(目錄號6578-1)、人類大腦、扁桃體(目錄號6574-1)和小鼠大腦(目錄號6616-1))以及用于cDNA合成和質(zhì)?？寺≡噭┖?目錄號18248-013)的LifeTechnologies SuperScript質(zhì)粒系統(tǒng)，構(gòu)建質(zhì)粒cDNA文庫L600C、L601C和L701C。對生產(chǎn)商的方案作如下三個(gè)改進(jìn)(1)在第一條鏈和第二條鏈的合成反應(yīng)中，用DEPC處理的水取代(αP32)dCTP。(2)在1％瓊脂糖凝膠，0.1μg/ml溴化乙錠，1xTAE凝膠上，通過凝膠電泳對Sal I適應(yīng)的cDNA進(jìn)行大小分級分離。從所述凝膠上切下溴化乙錠染色的≥3.0kb的cDNA。通過電洗脫(ISCO Little Blue Tank電洗脫儀和方法)，從所述瓊脂糖凝膠純化cDNA。(3)將所述凝膠純化、大小分級分離的Sal I切割cDNA連接到NotI-SalI消化的pCMV-SPORT6(Life Technologies Inc.，L600，L601)或pBluescript SK(Stratagene，L701)。
質(zhì)粒構(gòu)建人UP_11如下構(gòu)建包含預(yù)測的人UP_11基因序列的質(zhì)粒pCRII2HUP11_12B。
使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增。組合包含以下終濃度成分的反應(yīng)混合物0.1μg人類基因組DNA(Clonetech，目錄號6550-1)；10pmol正向引物5′ATGCATGCAAGCTTGCACCATGCTCCTGCTGGACTTGACTGC(SEQ ID NO22)；10pmol反向引物5′ATGCATGCCTCGAGTGACTCCAGCCGGGGTGA(SEQ IDNO23)；dATP、dTTP、dCTP和dGTP各0.2mM(Amersham PharmaciaBiotech目錄號27-2094-01)；1.5單位Taq DNA聚合酶；1x PCR反應(yīng)緩沖液(20mM Tris-HCl(PH8.4)，50mM KCl，Life Technologies，目錄號10342)；0.15mM MgCl2。所述混合物在94℃溫育1分鐘，然后是35個(gè)循環(huán)的94℃30秒鐘、65℃25秒鐘、72℃70秒鐘，最后在72℃溫育5分鐘(MJResearch DNA Engine Tetrad PTC-225)。
在1％瓊脂糖、0.1μg/ml溴化乙錠、0.5xTBE凝膠(Maniatis等，1982)上，通過凝膠電泳對所述PCR反應(yīng)產(chǎn)物(“DNA”)進(jìn)行大小分級分離。從瓊脂糖凝膠上切下合適大小的溴化乙錠染色的DNA條帶。使用Clonetech NucleoSpin核酸純化試劑盒(目錄號K3051-2)和生產(chǎn)商的方案，從所述瓊脂糖提取DNA。然后，使用Invitrogen TOPO TA克隆試劑盒(Invitrogen目錄號K4600)和生產(chǎn)商的改進(jìn)方案，將所述DNA亞克隆到載體pCRII-TOPO。概括地講，將約40ng所述凝膠純化的PCR產(chǎn)物與1μl生產(chǎn)商提供的pCRII-TOPO DNA(10ng/μl)和1μl稀釋的鹽溶液0.3M NaCl，0.15M MgCl2，在6μl終體內(nèi)內(nèi)溫育。所述混合物在室溫(約25℃)下溫育5分鐘。將1μl所述反應(yīng)物加入到電感受態(tài)細(xì)胞(ElectroMAX DH10B細(xì)胞，Life Technologies目錄號18290-015)，然后使用Biorad大腸桿菌脈沖儀(電壓1.8KV，3-5毫秒脈沖)進(jìn)行電穿孔。將1ml LB(Sambrook等，1989)加入到所述細(xì)胞中，然后所述混合物在37℃溫育1.5小時(shí)。所述混合物接種到LB-氨芐青霉素瓊脂平板上，在37℃溫育過夜。通過對從分離集落制備的質(zhì)粒DNA進(jìn)行限制性消化分析(標(biāo)準(zhǔn)分子技術(shù))和序列分析(ABI PrismBigDye終止子循環(huán)測序，目錄號4303154，ABI 377儀器)，鑒定包含所述預(yù)測的人UP_11序列的細(xì)菌克隆。使用QIAprep Spin Miniprep試劑盒和方案(Qiagen Inc，目錄號27106)，制備質(zhì)粒DNA。
質(zhì)粒構(gòu)建人OM_10如上文針對人UP_11所述構(gòu)建包含預(yù)測的人OM_10基因的質(zhì)粒pCRII2KOM10_6B，并對所述方法作如下改進(jìn)。
OM_10正向引物是5′ATGCATGCAAGCTTGCACCATGACGTCCACCTGCACCAACAG(SEQ ID NO24)，反向引物是5′ATGCATGCCTCGAGAGGAAAAGTAGCAGAATCG(SEQ IDNO25)。
人UP_11 cDNA克隆179、200、30的分離使用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)，用P32標(biāo)記的DNA探針，通過篩選約2,000,000個(gè)初級轉(zhuǎn)化子，從質(zhì)粒cDNA文庫L601C分離UP_11cDNA克隆179(SEQ ID NO1)、200(SEQ ID NO2)和30(SEQ IDNO3)。68℃下，在5xDenhardt’s、5xSSC、1％SDS、100μg/ml變性的鮭精中進(jìn)行菌落轉(zhuǎn)移雜交。所述菌落轉(zhuǎn)移在60℃下在0.1xSSC、1％SDS中洗滌。探針產(chǎn)生如下文所述。通過限制消化分析和序列分析(ABI Prism BigDye終止子循環(huán)測序，目錄號4303154，ABI 377儀器)，分析來自L601C的分離陽性雜交菌落的如上文所述制備的質(zhì)粒DNA。cDNA克隆179、30和200包含預(yù)測的UP_11可讀框。
探針產(chǎn)生如下產(chǎn)生在文庫篩選中使用的人UP_11特異性探針。使用EcoRI(New England Biolabs，目錄號101)，按照生產(chǎn)商的方案，限制性消化來自pCRII2HUP11_12B的質(zhì)粒DNA。在1.5％瓊脂糖，0.1μg/ml溴化乙錠，1x TAE凝膠上，通過凝膠電泳對限制性片段進(jìn)行大小分級分離。從所述瓊脂糖凝膠上切下合適大小(約1200bp)的溴化乙錠染色的DNA帶。然后，使用Clonetech NucleoSpin核酸純化試劑盒(目錄號K3051-2)和生產(chǎn)商的方案，從所述瓊脂糖提取DNA。使用Prime-ItII隨機(jī)引物標(biāo)記試劑盒和方案(Stratagene，目錄號300385)，用Redivue(αP32)dCTP(Amersham Pharmacia，目錄號AA0005)標(biāo)記所提取的DNA。用Amersham的NICK柱和方案(目錄號17-0855-02)，除去未摻入的(αP32)dCTP。
人OM_10克隆的分離根據(jù)上文如分離人UP_11cDNA克隆所述，分離人OM_10cDNA克隆，其中所述分離方法包括以下改進(jìn)。(1)篩選文庫L600C的2,000,000個(gè)初級轉(zhuǎn)化子，分離出一個(gè)包含預(yù)測的人OM_10可讀框的克隆。(2)用來自質(zhì)粒pCRII2KOM10_6B的約1500bp EcoRI限制性片段篩選所述文庫。
小鼠OM_10和UP_11克隆的分離根據(jù)上文如分離人UP_11cDNA克隆所述，分離小鼠UP_11和OM_10cDNA克隆，其中所述分離方法包括以下改進(jìn)。(1)對于每個(gè)基因，篩選文庫L701C的2,000,000個(gè)初級轉(zhuǎn)化子。(2)在60℃下，在5x Denhardt’s、4xSSC、1％SDS、100μg/ml變性鮭精中，進(jìn)行菌落轉(zhuǎn)移雜交。所述菌落轉(zhuǎn)移物在60℃下，在0.25xSSC、1％SDS中洗滌。(3)用質(zhì)粒pCRII2HUP11_12B的約1200bp EcoRI限制性片段或質(zhì)粒pCRII2KOM10_6B的約1500bp EcoRI限制性片段探測所述轉(zhuǎn)移物。
在所述UP_11篩選中，鑒定出兩個(gè)陽性雜交菌落，即分離物67.1(SEQ ID NO5)和分離物52.1(SEQ ID NO6)；這兩個(gè)菌落都包含根據(jù)對Celera小鼠基因組的TblastN搜索而預(yù)測的小鼠UP_11可讀框。在所述OM_10篩選中，鑒定出一個(gè)陽性雜交菌落，該菌落包含根據(jù)對Celera小鼠基因組的TblasN搜索而預(yù)測的小鼠OM_10可讀框。
實(shí)施例3人和小鼠UP_11和OM_10基因的組織表達(dá)人UP_11和OM_10為評價(jià)人UP_11和OM_10基因的組織分布，使用每道包含1μg來自各種人類組織的poly A+RNA(目錄號7780-1和7755-1，Clontech，Palo Alto，CA)的印跡，進(jìn)行RNA印跡分析，然后用人UP_11或OM_10特異性探針進(jìn)行探測。濾膜在68℃下，在10ml Express Hyb雜交溶液(Clontech，Palo Alto，CA)中預(yù)雜交1小時(shí)，然后加入約100ng32P標(biāo)記的探針。使用Stratagene Prime-It試劑盒，目錄號300392(Clontech，Palo Alto，CA)產(chǎn)生所述探針。
所述人UP_11特異性P32標(biāo)記的DNA探針包含SEQ ID NO1人UP_11序列中的核苷酸442-1653。人OM_10特異性P32標(biāo)記的DNA探針包含SEQ ID NO8人OM_10序列的核苷酸332-1,858。
在12道人類多組織RNA印跡分析(7780)中，使用人UP_11特異性探針，在全腦組織中檢測到約3kb、4.4kb和8kb轉(zhuǎn)錄物的信號強(qiáng)，而在骨骼肌中檢測到所述轉(zhuǎn)錄物的信號弱。在該RNA印跡分析的其它組織中沒有檢測到轉(zhuǎn)錄物。在腦IIMTN(7755)中，在小腦、大腦皮質(zhì)、髓質(zhì)、枕極、額葉、顳葉和豆?fàn)詈藱z測到同樣大小的轉(zhuǎn)錄物。使用人類多組織表達(dá)陣列(目錄號7775-1，用戶手冊PT3307-1)膜進(jìn)一步分析人UP_11的表達(dá)。在所述人類多組織表達(dá)陣列上檢測到與來自多組織的poly(A)+RNA的雜交與胎兒大腦、全腦、大腦皮質(zhì)、額葉、頂葉、枕葉、顳葉、大腦皮質(zhì)的旁中央腦回、腦橋、左小腦和右小腦、海馬、延髓、豆?fàn)詈?、accumbens和垂體腺有強(qiáng)雜交；與胼胝體、扁桃體、尾狀核、黑質(zhì)和丘腦有中度雜交，而與脊髓弱雜交。在該陣列上，其它組織中沒有檢測到雜交。
使用人OM_10特異性探針，在所述人類12道多組織RNA印跡分析(7780)的任何組織中都沒有檢測到轉(zhuǎn)錄物。在腦II MTN(7755)中，與豆?fàn)詈藘?nèi)約8kb和4kb的兩種轉(zhuǎn)錄物有強(qiáng)雜交。在小腦、大腦皮質(zhì)和髓質(zhì)中觀察與所述約8kb轉(zhuǎn)錄物較弱的雜交。在該RNA印跡上，沒有檢測到其它組織的轉(zhuǎn)錄物。使用人類多組織表達(dá)陣列(目錄號7775-1，用戶手冊PT3307-1)膜，進(jìn)一步分析人OM_10的表達(dá)。在所述人類多組織表達(dá)陣列中檢測到與來自多組織的poly(A)+RNA的雜交與豆?fàn)詈撕臀矤詈擞袕?qiáng)雜交，與延髓、海馬和扁桃體有弱雜交。在該陣列上沒有檢測到其它組織的雜交。
小鼠UP_11和OM_10為評價(jià)小鼠UP_11和OM_10轉(zhuǎn)錄物的組織分布，使用每道包含1μg從各種小鼠組織中分離的poly A+RNA(目錄號7762-1，Clontech，Palo Alto，CA)的印跡進(jìn)行RNA印跡分析，然后用小鼠UP_11或OM_10特異性探針進(jìn)行探測。所述Clontech濾膜在10ml ExpressHyb雜交溶液(Clontech，Palo Alto，CA)中于68℃預(yù)雜交1小時(shí)，然后加入約100ng P32標(biāo)記的探針。使用Stratagene Prime-It試劑盒，目錄號300392(Clontech，Palo Alto，CA)產(chǎn)生所述探針。小鼠MTN印跡(目錄號7762-1)如下通過RNA印跡分析評價(jià)小鼠腦內(nèi)的組織分布。顯微解剖小鼠(129Sv株或Balb/c株)腦的指定區(qū)域，立即在干冰上冷凍。使用Triazol(Gibco，15596)和生產(chǎn)商的方案，從所述冷凍組織分離總RNA。通過在變性凝膠(7.4％甲醛，1.1％瓊脂糖，1xMOPS緩沖液(0.1MMOPS，5mM乙酸鈉，1mM EDTA))上進(jìn)行電泳，分級分離總RNA。65℃下，溫育樣品緩沖液(62.5％甲酰胺，1.25xMPOS緩沖液)內(nèi)的RNA5分鐘，加入甲醛獲得7.4％的終濃度，然后在65℃下繼續(xù)溫育5分鐘，在冰上冷卻直到進(jìn)行電泳。在所述凝膠的每個(gè)樣品道上加樣約10-15μg總RNA。在20xSSC內(nèi)，將所述大小分級分離的RNA通過毛細(xì)管轉(zhuǎn)印，轉(zhuǎn)移到Hybond N+尼龍膜上過夜。然后，印跡在水中清洗，在UV下交聯(lián)。在65℃下，印跡在Quickhyb緩沖液(Stratagene)中與20μg/ml變性的超聲處理鮭精DNA(dSS)溫育15分鐘。然后，印跡在Quickhyb中與25μg/ml dSS和50ng P32標(biāo)記的探針溫育，如上文所述在65℃下合成2小時(shí)。在65℃下，在2xSSC，1％SDS中洗滌印跡兩次，每次10分鐘。在65℃下0.05xSSC，1％SDS中進(jìn)行最后兩次洗滌，每次45分鐘。將印跡對X-射線膠片曝光。
所述小鼠UP_11特異性P32標(biāo)記的DNA探針包含SEQ ID NO5小鼠UP_11序列的核苷酸684-2033。所述小鼠OM_10特異性P32標(biāo)記DNA探針包含SEQ ID NO10小鼠OM_10序列的核苷酸1080-1780。
在小鼠MTN(7762)上，使用所述小鼠UP_11特異性探針，在全腦中檢測到約4kb和4.4kb的轉(zhuǎn)錄物，在睪丸中檢測到多種弱雜交轉(zhuǎn)錄物(約9.5kb、約4kb、約2kb、約1kb)。在該RNA印跡分析中的其它組織內(nèi)沒有檢測到轉(zhuǎn)錄物。在所有測試的小鼠腦亞區(qū)組織中檢測到約4kb和4.4kb的兩種轉(zhuǎn)錄物，所述小鼠腦亞區(qū)組織是嗅球、紋狀體、皮質(zhì)、海馬、丘、中腦和小腦。
在小鼠MTN(7762)上，使用所述小鼠OM_10特異性探針，在全腦內(nèi)檢測到一種約6_kb的轉(zhuǎn)錄物。在該RNA印跡分析的其它組織中沒有檢測到轉(zhuǎn)錄物。在小鼠腦亞區(qū)紋狀體、下丘腦、丘、中腦和腦干中檢測到一種約6_kb的轉(zhuǎn)錄物。在嗅球、皮質(zhì)、海馬或小腦內(nèi)沒有檢測到轉(zhuǎn)錄物。
實(shí)施例4人和小鼠OM_10的染色體位置將從人血液中分離的淋巴細(xì)胞在補(bǔ)充10％胎牛血清和植物凝集素的α基本培養(yǎng)基(a-MEM)中于37℃培養(yǎng)68-72小時(shí)。用BrdU(0.18mg/ml，Sigma)處理所述淋巴細(xì)胞培養(yǎng)物，使細(xì)胞群體同步。用無血清培養(yǎng)基洗滌所述同步細(xì)胞三次，釋放所述阻斷劑，然后在含胸苷(2.5μg/ml；Sigma)的MEM中于37℃再培養(yǎng)6小時(shí)。收獲細(xì)胞，通過標(biāo)準(zhǔn)程序制做載玻片，所述標(biāo)準(zhǔn)程序包括低滲處理、固定和風(fēng)干。
小鼠染色體載玻片的制備從小鼠脾分離單核細(xì)胞，然后將其在補(bǔ)充15％胎牛血清，3μg/ml伴刀豆球蛋白A、10μg/ml脂多糖和5×10-5M巰基乙醇的RPMI 1640培養(yǎng)基中于37℃進(jìn)行培養(yǎng)。44小時(shí)后，用0.18mg/ml BrdU處理所述培養(yǎng)的淋巴細(xì)胞14小時(shí)。用補(bǔ)充胸苷(2.5μg/ml)的a-MEM洗滌所述同步細(xì)胞，并在所述培養(yǎng)基中于37℃下再培養(yǎng)4小時(shí)。根據(jù)制備人類染色體的常規(guī)方法(低滲處理、固定和風(fēng)干)制備染色體載玻片。
探針標(biāo)記、原位雜交和檢測用Gibco BRL BioNick標(biāo)記試劑盒(15℃，1小時(shí)(Heng等，1992))，用dATP生物素化DNA探針。根據(jù)Heng等，1992；和Heng和Tsui，1993，使用SeeDNA Biotech(PO Box 21082，Windsor Ontario Canada)進(jìn)行FISH檢測。概括地講，載玻片在55℃烘烤1小時(shí)。用RNA酶A處理后，所述載玻片在含70％甲酰胺的2xSSC中于70℃變性2分鐘，然后用乙醇脫水。探針在含50％甲酰胺和10％硫酸葡聚糖的雜交混合物中于75℃變性5分鐘。將探針加樣到變性的染色體載玻片上。雜交過夜后，使用已公開的方法(Heng等，1992)，洗滌、檢測和擴(kuò)增載玻片。分別記錄FISH信號和DAPI結(jié)合模式。通過CCD相機(jī)拍攝和組合影像，通過疊加FISH信號和DAPI分離的染色體帶，將所述FISH作圖信息指定到染色體帶上(Heng和Tsui，1993)。
使用來自人OM_10 cDNA克隆的約4.7kb NotI/SalI限制性片段作為應(yīng)用于所述人類染色體載玻片的探針。使用來自小鼠OM_10cDNA克隆的約5.3kb NotI/SalI限制性片段作為應(yīng)用于所述小鼠染色體載玻片上的探針。
所述小鼠OM_10探針與小鼠染色體XA5雜交。所述人OM_10探針與人類染色體Xq26-q27雜交。這些染色體位置是可能的同線區(qū)，這支持我們將這些基因命名為直向同源物的觀點(diǎn)(NCBI圖譜JacksonLaboratory，Mouse Genome Informatics)。
實(shí)施例5重組UP_11和OM_10蛋白在細(xì)菌細(xì)胞中的表達(dá)在本實(shí)施例中，UP_11或OM_10作為重組谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)融合蛋白在大腸桿菌中表達(dá)，分離并表征所述融合蛋白。具體地說，將UP_11或OM_10與GST融合，將該融合蛋白在大腸桿菌如PEB 199株中表達(dá)。由于預(yù)測人UP_11和OM_10多肽分別是約49kDa和57kDa，預(yù)測GST是26kDa，因此預(yù)測所述融合蛋白的分子量是約75kDa和83kDa。用IPTG誘導(dǎo)所述GST-UP_11或OM_10融合蛋白在PEB199中的表達(dá)。通過在谷胱甘肽珠上進(jìn)行的親和層析，從誘導(dǎo)后PEB 199株的粗細(xì)菌裂解物純化所述重組融合蛋白。
對從所述細(xì)菌裂解物純化的蛋白進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳分析，可以確定所得融合蛋白的分子量。
實(shí)施例6重組UP_11和OM_10蛋白在COS細(xì)胞中的表達(dá)為在COS細(xì)胞中表達(dá)UP_11或OM_10基因，可以使用InvitrogenCorporation(San Diego，CA)的pcDNA/Amp載體。該載體包含SV40復(fù)制起點(diǎn)、氨芐青霉素抗性基因、大腸桿菌復(fù)制起點(diǎn)、CMV啟動子和其后的多接頭區(qū)，以及SV40內(nèi)含子和聚腺苷酸化位點(diǎn)。將編碼完整UP_11或OM_10蛋白的DNA片段以及與所述片段的3′末端符合讀框地融合的HA標(biāo)記(Wilson等，1984)克隆到該載體的多接頭區(qū)，由此將所述重組蛋白的表達(dá)置于所述CMV啟動子的控制之下。
為構(gòu)建該質(zhì)粒，使用兩個(gè)引物，通過PCR擴(kuò)增所述UP_11或OM_10DNA序列。5′引物包含目標(biāo)限制位點(diǎn)，其后是所述UP_11或OM_10編碼序列從起始密碼子開始的約二十個(gè)核苷酸；3′引物序列包含與另一個(gè)目標(biāo)限制位點(diǎn)互補(bǔ)的序列、翻譯終止密碼子、HA標(biāo)記和所述UP_11或OM_10編碼序列的最后20個(gè)核苷酸。用合適限制酶消化所述PCR擴(kuò)增的片段以及所述pCDNA/Amp載體，然后使用CIAP酶(New England Biolabs，Beverly，MA)，使所述載體去磷酸化。所選用的所述兩個(gè)限制位點(diǎn)最好不同，以便以正確的取向插入所述UP_11或OM_10基因。將所述連接混合物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌細(xì)胞(可以使用從Stratagene Cloning Systems，La Jolla，CA獲得的HB101株，DH5a，SUPE)，將所述轉(zhuǎn)化培養(yǎng)物接種到氨芐青霉素培養(yǎng)基平板上，選擇抗性菌落。從轉(zhuǎn)化子分離質(zhì)粒DNA，通過限制性分析，檢查正確片段的存在。
隨后使用磷酸鈣或氯化鈣共沉淀法、DEAE-葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染法或電穿孔法，用所述UP_11或OM_10-pcDNA/Amp質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染COS細(xì)胞。在Sambrook等，1989中可以找到用于轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞的其它合適方法。使用HA特異性單克隆抗體，通過放射性標(biāo)記(可以使用從NEN，Boston，MA獲得的S35-甲硫氨酸或S35-半胱氨酸)和免疫沉淀(Harlow，E.和Lane，D.AntibodiesA Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1988)檢測所述UP_11或OM_10蛋白的表達(dá)。概括地講，用S35-甲硫氨酸(或S35-半胱氨酸)標(biāo)記所述細(xì)胞達(dá)8小時(shí)。然后收集培養(yǎng)基，用去污劑(RIPA緩沖液，150mM NaCl，1％NP-40，0.1％SDS，0.5％DOC，50mMTris，pH7.5)裂解所述細(xì)胞。用HA特異性單克隆抗體沉淀所述細(xì)胞裂解物和所述培養(yǎng)基。然后通過SDS-PAGE分析沉淀的蛋白?；蛘?，使用合適的限制性位點(diǎn)，將包含所述UP_11或OM_10編碼序列的DNA直接克隆到所述pCDNA/Amp載體的多接頭中。
采用上文所述的方法，將所得質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到COS細(xì)胞，然后使用UP_11或OM_10特異性單克隆抗體，通過放射性標(biāo)記和免疫沉淀檢測所述UP_11或OM_10蛋白的表達(dá)。
實(shí)施例7UP_11和OM_10在哺乳動物細(xì)胞中的表達(dá)細(xì)胞系的產(chǎn)生將人或小鼠UP_11或OM_10的可讀框連接到哺乳動物表達(dá)載體pCDNA3.1+zeo(Invitrogen，1600 Faraday Avenue，Carlsbad，CA92008)中。用所述質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK 293細(xì)胞，然后用500μg/ml零霉素(zeocin)進(jìn)行選擇。通過RT-PCR檢測零霉素抗性克隆的UP_11或OM_10表達(dá)，然后測試它們刺激cAMP產(chǎn)生的能力。
環(huán)化酶測定測定前24小時(shí)，將4×105細(xì)胞接種到96孔Biocoat細(xì)胞培養(yǎng)板(Becton Dickinson，1 Becton Drive，F(xiàn)ranklin Lakes，NJ 07417-1886)。然后將所述細(xì)胞在37℃下在Krebs-碳酸氫鹽緩沖液中溫育15分鐘。在500μM異丁基甲基黃嘌呤(IBMX)中預(yù)處理5分鐘，然后用1μM毛喉素或緩沖液刺激12分鐘，以測定基礎(chǔ)cAMP水平。使用SPA測定(Amersham Pharmacia Biotech，800 Centennial Avenue，Pistcataway，NJ08855)確定cAMP水平。
實(shí)施例8人UP_11和OM_10蛋白的表征在本實(shí)施例中，將人UP_11和OM_10蛋白的氨基酸序列與已知蛋白的氨基酸序列進(jìn)行比較，然后鑒定各種基序。人UP_11蛋白是一種包含451個(gè)氨基酸殘基的蛋白，其氨基酸序列示于SEQ IDNO4中。所述OM_10蛋白是一種包括508個(gè)氨基酸殘基的蛋白，其氨基酸序列示于SEQ ID NO9中。疏水性分析(圖2)表明人UP_11蛋白包含預(yù)期的7個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，它們位于氨基酸殘基11-16、36-49、69-83、112-121、160-182、242-250和286-287(Peak range，GvH scale，Toppred)。疏水性分析(圖2)表明人OM_10蛋白包含預(yù)期的7個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，它們位于氨基酸殘基34-49、86-90、109-118、155-162、188-214、403-418和437-446(Peak range，GvH scale，Toppred)。
實(shí)施例9抗OM_10和抗UP_11多克隆抗體的產(chǎn)生如下產(chǎn)生針對OM_10和UP_11肽片段的多克隆抗體表5用于產(chǎn)生多克隆抗血清的人OM_10肽PLYGWGQAAFDERNA (SEQ ID NO12)CVENEDEEGAEKKEE (SEQ ID NO13)QHEGEVKAKEGRMEA (SEQ ID NO14)CSIDLGEDDMEFGED (SEQ ID NO15)MLKKFFCKEKPPKE (SEQ ID NO16)表6用于產(chǎn)生多克隆抗體的人UP_11肽SSSALFDHALFGEVA (SEQ ID NO17)GAPQTTPHRTFGGG (SEQ ID NO18)CFFKPAPEEELRLPS (SEQ ID NO19)KQEPPAVDFRIPGQIAE(SEQ ID NO20)CLNRQIRGELSKQFV (SEQ ID NO21)實(shí)施例10UP_11和OM_10基因打靶載體的構(gòu)建使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，用全長人UP_11或OM_10編碼序列作為探針，從小鼠腦cDNA文庫(從Stratagene購買)分離部分鼠UP_11.或OM_10cDNA克隆。然后再次使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，用所述鼠UP_11或OM_10cDNA作為探針，篩選由129個(gè)小鼠株制備的基因組DNA文庫。然后將分離的鼠UP_11或OM_10基因組克隆亞克隆到質(zhì)粒載體pBluescript(從Stratagene購買)，以進(jìn)行限制性作圖、部分DNA測序和構(gòu)建打靶載體。為破環(huán)所述UP_11或OM_10基因的功能，可以制備打靶載體，其中將非同源DNA插入第一個(gè)編碼外顯子內(nèi)，在該過程中缺失起始密碼子和約600bp UP_11或OM_10編碼序列(包括前5個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域)，并使得剩余的下游UP_11或OM_10編碼序列相對翻譯起始而言不在讀框內(nèi)。因此，假如需要從所述UP_11或OM_10基因以其它方式剪接的轉(zhuǎn)錄物形成任何翻譯產(chǎn)物，它們將不包含GPCR正常功能所需的所有7個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域。使用標(biāo)準(zhǔn)分子克隆技術(shù)，構(gòu)建UP_11或OM_10打靶載體。所述打靶載體將包含在起始密碼子上游的1-5kb鼠UP_11或OM_10基因組序列，緊接其后是在磷酸甘油激酶啟動子控制下的新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(neo)基因。緊接在所述新霉素盒下游是1-5kb鼠UP_11或OM_10基因組序列，該基因組序列對應(yīng)于在鼠UP_11或OM_10起始密碼子下游的約2kb區(qū)。其后是在磷酸甘油激酶啟動子控制下的單純皰疹病毒胸苷激酶(HSV tk)基因。該載體中的上游和下游基因組盒采取與所述內(nèi)源鼠基因同樣的5′→3′取向。所述正選擇neo基因取代所述UP_11或OM_10序列的第一個(gè)編碼外顯子，并與UP_11或OM_10基因的取向相反，而所述負(fù)選擇HSV tk基因在所述構(gòu)建體的3′末端。該構(gòu)型允許應(yīng)用正選擇和負(fù)選擇方法進(jìn)行同源重組(Mansour等，1988)。在將所述質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)胚胎干細(xì)胞之前，所述質(zhì)粒通過限制酶消化線性化。
實(shí)施例11胚胎干細(xì)胞的轉(zhuǎn)染和分析將胚胎干細(xì)胞(例如D3株，Doestschman等，1985)在補(bǔ)充15％胎牛血清、2mM谷氨酸、青霉素(50u/ml)/鏈霉素(50u/ml)、非必需氨基酸、100uM 2-巰基乙醇和500u/ml白血病抑制因子的Dulbecco氏改良Eagles培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)的新霉素抗性胚胎成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層上進(jìn)行培養(yǎng)。每天更換培養(yǎng)基，每2-3天傳代培養(yǎng)細(xì)胞，然后通過電穿孔(25uF電容和400伏)，用線性化質(zhì)粒轉(zhuǎn)染所述細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后，在非選擇性培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述轉(zhuǎn)染細(xì)胞1-2天。隨后，所述細(xì)胞在含更昔洛韋和新霉素的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，其中最后3天在僅含新霉素的情況下進(jìn)行培養(yǎng)。擴(kuò)充所述克隆后，在液氮中冷凍等份細(xì)胞。從剩余細(xì)胞制備DNA，進(jìn)行基因組DNA分析，以鑒定其中在內(nèi)源UP_11或OM_10基因和所述打靶構(gòu)建體之間發(fā)生同源重組的克隆。為制備基因組DNA，在100mM Tris HCl pH8.5、5mM EDTA、0.2％SDS、200mM NaCl和100μg蛋白酶K/ml中裂解ES細(xì)胞克隆。通過異丙醇沉淀回收DNA，溶解于10mM Tris HCl pH8.0、0.1mM EDTA。為鑒定同源重組克隆，同限制酶消化從所述克隆分離的基因組DNA。限制性消化后，可以將所述DNA在0.8％瓊脂糖凝膠上分離，吸印到Hybond N膜上，在65℃下與以下探針雜交結(jié)合最接近所述打靶載體5′末端的UP_11或OM_10基因的區(qū)的探針，以及結(jié)合在所述打靶載體3′末端遠(yuǎn)端的UP_11或OM_10基因的區(qū)的探針。標(biāo)準(zhǔn)雜交后，在65℃下用40mM NaPO4(pH7.2)、1mM EDTA和1％SDS洗滌印跡，然后將所述印跡對X-射線膠片曝光。所述5′探針與野生型UP_11或OM_10等位基因的雜交導(dǎo)致通過具有neo插入片段的突變UP_11或OM_10等位基因的放射自顯影而容易辨別的片段。
實(shí)施例12UP_11或OM_10缺陷型小鼠的產(chǎn)生使雌性小鼠和雄性小鼠交配，在妊娠第3.5天分離胚泡。給每個(gè)胚泡注射來自實(shí)施例2所述克隆的10到12個(gè)細(xì)胞，將7個(gè)或8個(gè)胚泡轉(zhuǎn)移到假孕雌性子宮內(nèi)。在妊娠第18天，通過剖腹產(chǎn)接生幼崽，與代孕BALB/c母鼠放在一起飼養(yǎng)。所得雄性和雌性嵌合體分別與雌性和雄性BALB/C小鼠(無色素被毛)交配，通過129ES細(xì)胞基因組經(jīng)由種系傳代獲得的色素被毛顏色，確定種系遺傳。所述色素雜合子有可能攜帶被破環(huán)的UP_11或OM_10等位基因，因此使這些動物交配。孟德爾遺傳學(xué)預(yù)測約25％的后代對于UP_11或OM_10無效突變將是純合的。通過獲得尾基因組DNA，確定所述動物的基因型。
為證實(shí)UP_11或OM_10-/-小鼠不表達(dá)全長UP_11或OM_10mRNA轉(zhuǎn)錄物，從各種組織分離RNA，用UP_11或OM_10cDNA探針通過標(biāo)準(zhǔn)RNA雜交技術(shù)進(jìn)行分析，或通過逆轉(zhuǎn)錄酶-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)進(jìn)行分析。使用4M硫氰酸胍，從各種小鼠器官提取RNA，然后如Sambrook等(Molecular CloningA Laboratory Manual，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory press(1989))所述，在5.7M CsCl中離心。對腦或胎盤中UP_11或OM_10mRNA表達(dá)的RNA印跡分析將證明在來自UP_11或OM_10-/-小鼠的腦或胎盤中檢測不到全長UP_11或OM_10mRNA。特異性針對新霉素基因的引物將在UP_11或OM_10+/-動物體內(nèi)檢測到轉(zhuǎn)錄物，但在+/+動物體內(nèi)檢測不到轉(zhuǎn)錄物。使用RNA印跡分析和RT-PCR分析證實(shí)純合的UP_11或OM_10基因破環(huán)導(dǎo)致在UP_11或OM_10-/-小鼠體內(nèi)檢測不到全長UP_11或OM_10mRNA轉(zhuǎn)錄物。為檢查UP_11或OM_10缺陷型小鼠體內(nèi)的UP_11或OM_10蛋白表達(dá)，使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，在來自分離組織(包括腦和胎盤)的裂解物上進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡分析。這些結(jié)果將證實(shí)純合的UP_11或OM_10基因破環(huán)導(dǎo)致在-/-小鼠體內(nèi)檢測不到UP_11或OM_10蛋白。
實(shí)施例13對UP_11或OM_10產(chǎn)生的抑制設(shè)計(jì)作為本發(fā)明組合物的RNA分子在本實(shí)驗(yàn)中，所有RNA分子長約600nt，并且所有RNA分子設(shè)計(jì)為不能產(chǎn)生功能性UP_11或OM_10蛋白。所述分子沒有帽子序列和poly-A序列；不存在天然起始密碼子，所述RNA不編碼全長產(chǎn)物。設(shè)計(jì)下列RNA分子(1)與部分UP_11或OM_10鼠信使RNA(mRNA)同源的單鏈(ss)有義多核苷酸序列；(2)與部分UP_11或OM_10鼠mRNA互補(bǔ)的ss反義RNA多核苷酸序列，(3)包含有義和反義部分UP_11或OM_10鼠mRNA多核苷酸序列的雙鏈(ds)RNA分子，(4)與部分UP_11或OM_10鼠異源RNA(hnRNA)同源的ss有義RNA多核苷酸，(5)與部分UP_11或OM_10鼠hnRNA互補(bǔ)的ss反義RNA多核苷酸序列，(6)包含有義和反義UP_11或OM_10鼠hnRNA多核苷酸序列的ds RNA分子，(7)與部分UP_11或OM_10啟動子的上鏈同源的ss鼠RNA多核苷酸序列，(8)與部分UP_11或OM_10啟動子的下鏈同源的ss鼠RNA多核苷酸序列，以及(9)包含與UP_11或OM_10啟動子的上下兩條鏈同源的鼠多核苷酸序列的ds RNA分子。
通過對在一個(gè)末端攜帶T7啟動子的PCR產(chǎn)物進(jìn)行的T7 RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄，可以產(chǎn)生以上(1)-(9)的不同RNA分子。在需要有義RNA的情況下，將T7啟動子置于PCR正向引物的5′端。在需要反義RNA的情況下，將T7啟動子置于PCR反向引物的5′端。當(dāng)需要dsRNA時(shí)，在T7轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中可以包括這兩種類型的PCR產(chǎn)物。或者，可以將有義RNA和反義RNA在轉(zhuǎn)錄后在退火條件下混合在一起，形成ds RNA。
編碼折回類型RNA的表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建可以使用本申請中公開的信息，構(gòu)建編碼部分UP_11或OM_10基因反向重復(fù)的表達(dá)質(zhì)粒。可以通過PCR擴(kuò)增制備編碼UP_11或OM_10折回轉(zhuǎn)錄物的DNA片段，將其導(dǎo)入載體的合適限制位點(diǎn)，所述載體包括轉(zhuǎn)錄所述UP_11或OM_10折回轉(zhuǎn)錄物所需的元件。所述DNA片段將編碼包含長至少約600核苷酸的UP_11或OM_10基因片段，其后是至少長10bp但不超過200bp的間隔區(qū)序列，然后是所選UP_11或OM_10序列的反向互補(bǔ)序列。用所述構(gòu)建體轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞將僅產(chǎn)生折回RNA，其中互補(bǔ)靶基因序列形成雙螺旋。
測定給Balb/c小鼠(5只小鼠/組)按范圍10μg-500μg的劑量顱內(nèi)注射上述鼠UP_11或OM_10鏈特異性RNA或?qū)φ?。在三周時(shí)間內(nèi)，每四天從所述小鼠的樣品收獲腦組織，使用本文公開的抗體測定UP_11或OM_10水平，或者通過RNA印跡分析檢測降低的RNA水平。
根據(jù)本發(fā)明，接受源于UP_11或OM_10mRNA、UP_11或OM_10hnRNA的ds RNA分子以及源于UP_11或OM_10啟動子的ds RNA的小鼠證明UP_11或OM_10產(chǎn)生的降低或抑制。除非所述RNA分子具有形成一定水平雙鏈性的能力，否則在接受單鏈UP_11或OM_10衍生的RNA分子的小鼠血清中，觀察到中度抑制效應(yīng)(如果有的話)。
實(shí)施例14本發(fā)明預(yù)防疾病的方法體內(nèi)測定用實(shí)施例10中描述的沒有產(chǎn)生UP_11或OM_10蛋白的能力的UP_11或OM_10R特異性RNA分子和UP_11或OM_10特異性RNA分子作為對照，可以評價(jià)小鼠通過利用本發(fā)明注射的UP_11或OM_10特異性RNA分子對UP_11或OM_10相關(guān)疾病的保護(hù)。
通過給Balb/c小鼠(5只小鼠/組)按10-500μg RNA劑量范圍顱內(nèi)注射所述RNA分子，對所述小鼠進(jìn)行免疫。在注射RNA后第1、2、4和7天，觀察所述小鼠UP_11或OM_10相關(guān)表型改變的體征。
根據(jù)本發(fā)明，因?yàn)榻邮鼙景l(fā)明包含UP_11或OM_10序列的dsRNA分子的小鼠可能顯示保護(hù)所述小鼠免患UP_11或OM_10相關(guān)疾病。接受對照RNA分子的小鼠可能不受保護(hù)。預(yù)期接受包含UP_11或OM_10序列的ss RNA分子的小鼠可能受到最小保護(hù)(如果有的話)，除非這些分子具有在體內(nèi)至少部分變成雙鏈化的能力。
根據(jù)本發(fā)明，因?yàn)楸景l(fā)明的dsRNA分子沒有產(chǎn)生UP_11或OM_10蛋白的能力，因此通過將所述RNA分子傳遞到動物體內(nèi)而提供的保護(hù)是由于基因特異性的非免疫介導(dǎo)機(jī)制所致。
實(shí)施例15果蠅和中國倉鼠培養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)的RNA干涉為觀察RNA干涉的效應(yīng)，可以鑒定并使用天然表達(dá)UP_11或OM_10的細(xì)胞系，或者通過眾所周知的方法(如本文概述)構(gòu)建表達(dá)UP_11或OM_10轉(zhuǎn)基因的細(xì)胞系。例如，描述果蠅細(xì)胞和CHO細(xì)胞的應(yīng)用。將果蠅S2細(xì)胞和中國倉鼠CHO-K1細(xì)胞分別在Schneider培養(yǎng)基(Gibco BRL)中于25℃進(jìn)行培養(yǎng)，或者在Eagle氏培養(yǎng)基(GibcoBRL)中于37℃進(jìn)行培養(yǎng)。這兩種培養(yǎng)基中都可以補(bǔ)充10％熱失活胎牛血清(Mitsubishi Kasei)和抗生素(10單位/ml青霉素(Meiji)和50μg/ml鏈霉素(Meiji))。
轉(zhuǎn)染和RNAi活性測定將S2細(xì)胞和CHO-K1細(xì)胞分別以1×106和3×105細(xì)胞/ml接種到24孔板各孔內(nèi)。1天后，使用磷酸鈣沉淀法，用UP_11或OM_10dsRNA(80pg到3μg)轉(zhuǎn)染細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后20小時(shí)收獲細(xì)胞，測量UP_11或OM_10基因表達(dá)。
實(shí)施例16脊椎動物細(xì)胞系內(nèi)的反義抑制可以使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)進(jìn)行反義，其中包括應(yīng)用試劑盒如Sequitur Inc.(Natick，MA)的試劑盒。以下程序利用硫代磷酸寡聚脫氧核苷酸和陽離子脂質(zhì)。選擇與所述mRNA 5′端互補(bǔ)的寡聚物，以便包括翻譯起始位點(diǎn)。
1)在接種所述細(xì)胞前，通過將0.2％過濾除菌的明膠溫育30分鐘，然后用PBS洗滌一次，用所述明膠包被所述板壁，以促進(jìn)貼壁。讓細(xì)胞生長至40-80％匯合。用Hela細(xì)胞作為陽性對照。
2)用無血清培養(yǎng)基(例如Opti-MEMA，得自Gibco-BRL)洗滌所述細(xì)胞。
3)與合適的陽離子脂質(zhì)(例如Oligofectibn A，得自Sequitur，Inc.)混合，然后加入到聚苯乙烯管內(nèi)不含抗生素的無血清培養(yǎng)基中。根據(jù)所述脂質(zhì)的來源，其濃度可以變化。將100μM貯液(2μl/ml)的寡聚體加入到盛有無血清培養(yǎng)基/陽離子脂質(zhì)的管內(nèi)，至終濃度約為200nM(范圍50-400nM)，然后顛倒混合。
4)將所述寡聚體/培養(yǎng)基/陽離子脂質(zhì)溶液加入到所述細(xì)胞中(在24孔板上，每孔約0.5mL)，然后于37℃溫育4小時(shí)。
5)用培養(yǎng)基溫和洗滌所述細(xì)胞，然后加入完全生長培養(yǎng)基。讓所述細(xì)胞生長24小時(shí)。一定百分比的所述細(xì)胞可能會脫離該板，或者裂解。
收獲細(xì)胞，然后測量UP_11或OM_10基因表達(dá)。
實(shí)施例17通過基因打靶產(chǎn)生轉(zhuǎn)染細(xì)胞株當(dāng)轉(zhuǎn)染DNA通過同源重組事件或者整合到染色體DNA序列中或者部分取代染色體DNA序列時(shí)，發(fā)生基因打靶。雖然所述事件可能出現(xiàn)在任何給定轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)中，但是當(dāng)它們通常被大量質(zhì)粒DNA通過非同源或非法重組而整合的事件所屏蔽。
在人類細(xì)胞中產(chǎn)生用于選擇基因打靶事件的構(gòu)建體一種選擇中靶事件的方法是根據(jù)由于轉(zhuǎn)染DNA整合而引起的基因功能損失進(jìn)行遺傳選擇。人類HPRT基因座編碼次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶。根據(jù)Hprt細(xì)胞在含核苷類似物6-硫代鳥嘌呤(6-TG)的培養(yǎng)基中的生長情況進(jìn)行選擇攜帶野生型(HPRT+)等位基因的細(xì)胞被6-TG殺死，而攜帶突變型(hprt-)等位基因的細(xì)胞可以存活。因此，在6-TG培養(yǎng)基中可以選擇攜帶破環(huán)HPRT基因功能的中靶事件的細(xì)胞。
為構(gòu)建用于打靶HPRT基因座的質(zhì)粒，可以將從HPRT序列(Genebank名稱HUMHPRTB；Edwards等，1990)的位置11,960-18,869延伸并且包括所述HPRT基因外顯子2和3的6.9kb HindIII片段亞克隆到pUC12的HindIII位點(diǎn)中。在所述HPRT基因片段外顯子3內(nèi)的單一XhoI位點(diǎn)切割所得克隆，插入包含來自pMClNeo(Stratagene)的neo基因并且外顯子3編碼序列被破環(huán)的1.1kb SalI-XhoI片段。選擇一個(gè)取向，即neo轉(zhuǎn)錄的方向與HPRT轉(zhuǎn)錄方向相反，命名為pE3Neo。用neo被破環(huán)的形式取代正常HPRT外顯子3將產(chǎn)生hprt-，6-TG抗性表型。所述細(xì)胞也抗G418。
將有治療意義的基因定向插入到人類基因組中的構(gòu)建體的產(chǎn)生及其在基因打靶中的應(yīng)用可以用pE3Neo的變異體打靶UP_11或OM_10基因至受體原代或二代細(xì)胞基因組內(nèi)的特定位置，所述pE3Neo的變異體中，在HPRT編碼區(qū)內(nèi)、鄰近neo基因或其附近插入U(xiǎn)P_11或OM_10基因?？梢詷?gòu)建所述pE3Neo的變異體，打靶UP_11或OM_10基因至HPRT基因座。
構(gòu)建包含UP_11或OM_10基因并連接小鼠金屬硫蛋白(mMT)啟動子的DNA片段。用在neo片段和HPRT外顯子3的接頭部位(所述插入片段的3′連接到外顯子3)進(jìn)行切割的酶消化pE3Neo?？梢詫⒕€性化pE3Neo片段連接到所述UP_11或OM_10-mMT片段。
通過限制酶分析，篩選用所述連接混合物轉(zhuǎn)染產(chǎn)生的細(xì)菌菌落中所述UP_11或OM_10-mMT片段的單拷貝插入。選擇其中UP_11或OM_10DNA與neo基因以相同方向轉(zhuǎn)錄的插入突變體，命名為pE3Neo/UP_11或OM_10。消化pE3Neo/UP_11或OM_10，釋放包含HPRT、neo和mMT-UP_11或OM_10序列的片段。處理經(jīng)消化的DNA，轉(zhuǎn)染到原代或二代人成纖維細(xì)胞中。選擇G418rTGr菌落，分析所述mMT-UP_11或OM_10和neo序列定向插入到所述HPRT基因中?？梢允褂帽疚膭e處描述的抗體，測定各個(gè)菌落的UP_11或OM_10表達(dá)。
可以用pE3Neo/UP_11或OM_10轉(zhuǎn)染二代人成纖維細(xì)胞，分析硫代鳥嘌呤抗性菌落的穩(wěn)定UP_11或OM_10表達(dá)，以及進(jìn)行限制酶分析和DNA印跡雜交分析。
可以擴(kuò)充利用同源重組打靶UP_11或OM_10基因至細(xì)胞基因組DNA內(nèi)的特定位置，使其對于通過插入基因而產(chǎn)生具有藥用目的的產(chǎn)物(例如藥物，基因治療)更加有用，由此通過將細(xì)胞暴露于合適的藥物選擇方案，可以選擇包含所述基因擴(kuò)增拷貝的細(xì)胞。例如，可以在緊接pE3neo/UP_11或OM_10內(nèi)的UP_11或OM_10或neo基因位置插入dhfr、ada或CAD基因，修飾pE3neo/UP_11或OM_10。用所述質(zhì)粒轉(zhuǎn)染原代細(xì)胞、二代細(xì)胞或無限增殖化細(xì)胞，然后鑒定正確的中靶事件。用適于選擇包含擴(kuò)增基因的細(xì)胞的濃度逐漸增加的藥物進(jìn)一步處理這些細(xì)胞(對于dhfr，選擇劑是氨甲蝶呤，對于CAD，選擇劑是N-(磷酸乙?；?-L-天冬氨酸(PALA)，而對于ada，選擇劑是腺嘌呤核苷(例如亞硝基羥基丙氨酸)。用這種方式，有治療意義的基因的整合將與選擇擴(kuò)增拷貝的基因一起共擴(kuò)增。因此，對于產(chǎn)生有治療用途的基因的細(xì)胞的基因工程，通過預(yù)先選擇所述打靶構(gòu)建體整合的位點(diǎn)和所述擴(kuò)增拷貝在擴(kuò)增細(xì)胞內(nèi)的位點(diǎn)，可以容易地進(jìn)行控制。
在原代、二代和無限增殖化人成纖維細(xì)胞中，構(gòu)建用于使UP_11或OM_10基因置于小鼠金屬硫蛋白啟動子控制之下的打靶質(zhì)粒下面用于舉例說明本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，其中改變UP_11或OM_10基因上游的正常正調(diào)節(jié)序列和負(fù)調(diào)節(jié)序列，允許在原代、二代或無限增殖化人成纖維細(xì)胞或不以顯著量表達(dá)UP_11或OM_10的其它細(xì)胞內(nèi)表達(dá)UP_11或OM_10。
選擇位于UP_11或OM_10編碼區(qū)上游的單一SEQ ID NO1、SEQID NO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO5、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8或SEQ ID NO10序列，然后連接到小鼠金屬硫蛋白啟動子，作為打靶序列。通常，通過已知方法將來自mMT-I基因的1.8kb EcoRI-BglII(不包含mMT編碼序列；Hamer和Walling，1982；也可以通過已知方法，使用根據(jù)對Genbank得到的mXT序列(即MUSMTI、MUSMTIP、MUSMTIPRM)的分析而設(shè)計(jì)的PCR引物，從小鼠基因組DNA分離該片段)平端化，與5′UP_11或OM_10序列連接。分析所得克隆的取向，使用合適DNA打靶原代和二代人成纖維細(xì)胞或其它不以顯著量表達(dá)UP_11或OM_10的細(xì)胞。
當(dāng)需要修飾、缺失和/或取代在所述起始靶序列上游的負(fù)調(diào)節(jié)元件或增強(qiáng)子時(shí)，可以使用其它上游序列。
上述克隆策略允許體外修飾UP_11或OM_10上游的序列，以隨后定向轉(zhuǎn)染原代、二代或無限增殖化人成纖維細(xì)胞或不以顯著量表達(dá)UP_11或OM_10的其它細(xì)胞。所述策略描述簡單地插入mMT啟動子，允許缺失負(fù)調(diào)節(jié)區(qū)，以及允許缺失負(fù)調(diào)節(jié)區(qū)并用具有寬宿主細(xì)胞活性的增強(qiáng)子取代所述負(fù)調(diào)節(jié)區(qū)。
對鄰接UP_11或OM_10基因的序列進(jìn)行打靶并通過篩選分離被擊中靶的原代、二代和無限增殖化人成纖維細(xì)胞可以通過苯酚抽提和乙醇沉淀，純化包含mMT啟動子和UP_11或OM_10上游序列的打靶序列，然后轉(zhuǎn)染到原代或二代人成纖維細(xì)胞中。將轉(zhuǎn)染細(xì)胞接種到150mm培養(yǎng)皿內(nèi)的人成纖維細(xì)胞營養(yǎng)培養(yǎng)基中。48小時(shí)后，將細(xì)胞以10,000個(gè)細(xì)胞/cm2(約20,000個(gè)細(xì)胞/孔)的密度接種到24孔板內(nèi)，以致于當(dāng)打靶以每106個(gè)可克隆細(xì)胞出現(xiàn)1個(gè)事件的頻率發(fā)生時(shí)，分離一個(gè)表達(dá)集落將需要約50孔細(xì)胞。轉(zhuǎn)染DNA已經(jīng)打靶至UP_11或OM_10上游同源區(qū)的DNA將表達(dá)處于mMT啟動子控制之下的UP_11或OM_10。10天后，測定全孔上清液中UP_11或OM_10的表達(dá)。使用已知方法，從表現(xiàn)UP_11或OM_10合成的孔分離克隆，通常通過測定分離到各個(gè)孔或板的不均一細(xì)胞群體的級分，測定這些陽性孔的組分，然后根據(jù)需要重復(fù)，最后通過篩選以每孔一個(gè)細(xì)胞接種的96孔微量滴定板，分離中靶集落。也可以使用特異性針對所述打靶序列的引物，通過PCR分析擴(kuò)增片段的來自整個(gè)板裂解物的DNA。用胰蛋白酶消化陽性平板，以順序降低的稀釋度再次接種，根據(jù)需要重復(fù)DNA制備和PCR步驟，分離中靶細(xì)胞。
對鄰接人UP_11或OM_10基因的序列進(jìn)行打靶并通過正選擇系統(tǒng)或正/負(fù)混合選擇系統(tǒng)分離被擊中靶的原代、二代和無限增殖化人成纖維細(xì)胞構(gòu)建5′UP_11或OM_10-mMT打靶序列和用其它上游序列衍生所述序列而獲得的衍生物可以包括鄰近mMT啟動子插入neo基因的額外步驟。此外，可以插入負(fù)選擇標(biāo)記，例如gpt(來自PMSG(Pharmacia)或其它合適來源)。在前一種情況下，分離G418r克隆，通過PCR擴(kuò)增進(jìn)行篩選，或者通過對從克隆庫制備的DNA的限制酶分析和DNA印跡雜交分析，鑒定中靶克隆。在后一種情況下，將G418rU克隆接種在含6-硫代黃嘌呤的培養(yǎng)基上，針對gpt基因的整合進(jìn)行選擇(Besnard等，1987)。此外，可以將HSV-TK基因置于與gpt相反方向的插入片段內(nèi)，通過讓細(xì)胞在含400μg/ml G418、100μM 6-硫代黃嘌呤和25μg/ml更昔洛韋的人成纖維細(xì)胞營養(yǎng)培養(yǎng)基內(nèi)生長，允許對neo以及gpt和TK進(jìn)行選擇。所述雙負(fù)選擇將為真正的中靶事件提供接近絕對的選擇，而DNA印跡分析提供最后確認(rèn)。
本文描述的打靶方法也可以用于激活無限增殖化人類細(xì)胞(例如HT1080成纖維細(xì)胞、HeLa細(xì)胞、MCF-7乳腺癌細(xì)胞、K-562白血病細(xì)胞、KB癌細(xì)胞或2780AD卵巢癌細(xì)胞)中的UP_11或OM_10表達(dá)，以產(chǎn)生UP_11或OM_10，用于常規(guī)遞藥。
可以修飾在本實(shí)施例中描述和使用的打靶構(gòu)建體，以包括用于選擇細(xì)胞的可擴(kuò)增選擇標(biāo)記(例如ada、dhfr或CAD)，其中擴(kuò)增所述活化內(nèi)源基因和所述可擴(kuò)增選擇標(biāo)記。所述表達(dá)或能夠表達(dá)編碼UP_11或OM_10產(chǎn)物的內(nèi)源基因的細(xì)胞可以用于產(chǎn)生蛋白，以用于常規(guī)遞藥或用于基因治療。
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<221>外顯子<222>(1)..(1317)<223>
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Phe Gly Glu Val Ala Cys Arg Leu Tyr Leu Phe Leu Ser Val Cys Phe110 115 120 125gtc agc ctg gcc atc ctc tcg gtg tca gcc atc aat gtg gag cgc tac1093Val Ser Leu Ala Ile Leu Ser Val Ser Ala Ile Asn Val Glu Arg Tyr130 135 140tat tac gta gtc cac ccc atg cgc tac gag gtg cgc atg acg ctg ggg1141Tyr Tyr Val Val His Pro Met Arg Tyr Glu Val Arg Met Thr Leu Gly145 150 155ctg gtg gcc tct gtg ctg gtg ggt gtg tgg gtg aag gcc ttg gcc atg1189Leu Val Ala Ser Val Leu Val Gly Val Trp Val Lys Ala Leu Ala Met160 165 170gct tct gtg cca gtg ttg gga agg gtc tcc tgg gag gaa gga gct ccc1237Ala Ser Val Pro Val Leu Gly Arg Val Ser Trp Glu Glu Gly Ala Pro175 180 185agt gtc ccc cca ggc tgt tca ctc cag tgg agc cac agt gcc tac tgc1285Ser Val Pro Pro Gly Cys Ser Leu Gln Trp Ser His Ser Ala Tyr Cys190 195 200 205cag ctt ttt gtg gtg gtc ttt gct gtc ctt tac ttt ctg ttg ccc ctg1333Gln Leu Phe Val Val Val Phe Ala Val Leu Tyr Phe Leu Leu Pro Leu210 215 220ctc ctc ata ctt gtg gtc tac tgc agc atg ttc cga gtg gcc cgc gtg1381Leu Leu Ile Leu Val Val Tyr Cys Ser Met Phe Arg Val Ala Arg Val225 230 235gct gcc atg cag cac ggg ccg ctg ccc acg tgg atg gag aca ccc cgg1429Ala Ala Met Gln His Gly Pro Leu Pro Thr Trp Met Glu Thr Pro Arg240 245 250caa cgc tcc gaa tct ctc agc agc cgc tcc acg atg gtc acc agc tca1477Gln Arg Ser Glu Ser Leu Ser Ser Arg Ser Thr Met Val Thr Ser Ser255 260 265ggg gcc ccc cag acc acc cca cac cgg acg ttt ggg gga ggg aaa gca1525Gly Ala Pro Gln Thr Thr Pro His Arg Thr Phe Gly Gly Gly Lys Ala270 275 280 285gca gtg gtt ctc ctg gct gtg ggg gga cag ttc ctg ctc tgt tgg ttg1573Ala Val Val Leu Leu Ala Val Gly Gly Gln Phe Leu Leu Cys Trp Leu290 295 300ccc tac ttc tct ttc cac ctc tat gtt gcc ctg agt gct cag ccc att1621Pro Tyr Phe Ser Phe His Leu Tyr Val Ala Leu Ser Ala Gln Pro Ile
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<400>10gctggctgga cgtacgggca tatactcggt gtcccgctcc cgctgagcac cgctgctcct 60accactcggt gcgagctctc agccgcctgt gccccgaaag gtggtcagag gaaacgcggc 120gagccccgag ggatcggtct ccggttcctg tggcgcgaag ccttcagcag caacagatcg 180
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1.一種分離的多核苷酸，所述多核苷酸包含以下核酸序列所述核酸序列編碼包含SEQ ID NO4的氨基酸序列的多肽。
2.權(quán)利要求1的多核苷酸，所述多核苷酸還包含編碼異源蛋白的核酸序列。
3.一種重組表達(dá)載體，所述重組表達(dá)載體包含權(quán)利要求1的多核苷酸。
4.權(quán)利要求3的載體，其中所述多核苷酸包含SEQ ID NO1、SEQ ID NO2或SEQ ID NO3的核酸序列。
5.一種基因工程宿主細(xì)胞，所述基因工程宿主細(xì)胞用權(quán)利要求3的載體轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)化或感染。
6.權(quán)利要求5的宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞是一種哺乳動物宿主細(xì)胞。
7.一種分離的多核苷酸，所述多核苷酸包含以下核酸序列所述核酸序列編碼包含SEQ ID NO7的氨基酸序列的多肽。
8.權(quán)利要求7的多核苷酸，所述多核苷酸還包含編碼異源蛋白的核酸序列。
9.一種重組表達(dá)載體，所述重組表達(dá)載體包含權(quán)利要求7的多核苷酸。
10.權(quán)利要求9的載體，其中所述多核苷酸包含SEQ ID NO5或SEQ ID NO6的核酸序列。
11.一種基因工程宿主細(xì)胞，所述基因工程宿主細(xì)胞用權(quán)利要求9的載體轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)化或感染。
12.權(quán)利要求11的宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞是一種哺乳動物宿主細(xì)胞。
13.一種分離的多核苷酸，所述多核苷酸包含以下核酸序列所述核酸序列編碼包含SEQ ID NO9的氨基酸序列的多肽。
14.權(quán)利要求13的多核苷酸，所述多核苷酸還包含編碼異源蛋白的核酸序列。
15.一種重組表達(dá)載體，所述重組表達(dá)載體包含權(quán)利要求13的多核苷酸。
16.權(quán)利要求15的載體，其中所述多核苷酸包含SEQ ID NO8的核酸序列。
17.一種基因工程宿主細(xì)胞，所述基因工程宿主細(xì)胞用權(quán)利要求15的載體轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)化或感染。
18.權(quán)利要求17的宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞是一種哺乳動物宿主細(xì)胞。
19.一種分離的多核苷酸，所述多核苷酸包含以下核酸序列所述核酸序列編碼包含SEQ ID NO11的氨基酸序列的多肽。
20.權(quán)利要求19的多核苷酸，所述多核苷酸還包含編碼異源蛋白的核酸序列。
21.一種重組表達(dá)載體，所述重組表達(dá)載體包含權(quán)利要求19的多核苷酸。
22.權(quán)利要求21的載體，其中所述多核苷酸包含SEQ ID NO10的核酸序列。
23.一種基因工程宿主細(xì)胞，所述基因工程宿主細(xì)胞用權(quán)利要求21的載體轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)化或感染。
24.權(quán)利要求23的宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞是一種哺乳動物宿主細(xì)胞。
25.一種分離的多肽，所述多肽包含SEQ ID NO4的氨基酸序列。
26.一種分離的多肽，所述多肽包含SEQ ID NO7的氨基酸序列。
27.一種分離的多肽，所述多肽包含SEQ ID NO9的氨基酸序列。
28.一種分離的多肽，所述多肽包含SEQ ID NO11的氨基酸序列。
29.一種分離的多核苷酸，所述多核苷酸包含SEQ ID NO1的核酸序列或其簡并變異體。
30.權(quán)利要求41的多核苷酸，其中SEQ ID NO1的編碼區(qū)包含核苷酸298到1,653。
31.一種RNA分子，所述RNA分子與包含SEQ ID NO1的核酸序列或其簡并變異體的多核苷酸反義。
32.權(quán)利要求31的RNA，其中所述RNA與SEQ ID NO1從約核苷酸1到約核苷酸297或者從約核苷酸1,654到約核苷酸3,824的多核苷酸反義。
33.一種分離的多核苷酸，所述多核苷酸包含SEQ ID NO2的核酸序列或其簡并變異體。
34.權(quán)利要求33的多核苷酸，其中SEQ ID NO2的編碼區(qū)包含核苷酸1到1,313。
35.一種RNA分子，所述RNA分子與包含SEQ ID NO2的核酸序列或其簡并變異體的多核苷酸反義。
36.權(quán)利要求35的RNA，其中所述RNA與SEQ ID NO2從約核苷酸1,314到約核苷酸3,405的多核苷酸反義。
37.一種分離的多核苷酸，所述多核苷酸包含SEQ ID NO3的核酸序列或其簡并變異體。
38.權(quán)利要求37的多核苷酸，其中SEQ ID NO3的編碼區(qū)包含核苷酸671到2,026。
39.一種RNA分子，所述RNA分子與包含SEQ ID NO3的核酸序列或其簡并變異體的多核苷酸反義。
40.權(quán)利要求39的RNA，其中所述RNA與SEQ ID NO3從約核苷酸1到約核苷酸670或者從約核苷酸2,027到約核苷酸3,779的多核苷酸反義。
41.一種分離的多核苷酸，所述多核苷酸包含SEQ ID NO5的核酸序列或其簡并變異體。
42.權(quán)利要求41的多核苷酸，其中SEQ ID NO5的編碼區(qū)包含核苷酸684到2,033。
43.一種RNA分子，所述RNA分子與包含SEQ ID NO5的核酸序列或其簡并變異體的多核苷酸反義。
44.權(quán)利要求43的RNA，其中所述RNA與SEQ ID NO5從約核苷酸1到約核苷酸683或者從約核苷酸2,034到約核苷酸3,384的多核苷酸反義。
45.一種分離的多核苷酸，所述多核苷酸包含SEQ ID NO6的核酸序列或其簡并變異體。
46.權(quán)利要求45的多核苷酸，其中SEQ ID NO6的編碼區(qū)包含核苷酸685到2,034。
47.一種RNA分子，所述RNA分子與包含SEQ ID NO6的核酸序列或其簡并變異體的多核苷酸反義。
48.權(quán)利要求47的RNA，其中所述RNA與SEQ ID NO6從約核苷酸1到約核苷酸684或者從約核苷酸2,034到約核苷酸3,384的多核苷酸反義。
49.一種分離的多核苷酸，所述多核苷酸包含SEQ ID NO8的核酸序列或其簡并變異體。
50.權(quán)利要求49的多核苷酸，其中SEQ ID NO8的編碼區(qū)包含核苷酸332到1,858。
51.一種RNA分子，所述RNA分子與包含SEQ ID NO8的核酸序列或其簡并變異體的多核苷酸反義。
52.權(quán)利要求51的RNA，其中所述RNA與SEQ ID NO8從約核苷酸1到約核苷酸331或者從約核苷酸1,859到約核苷酸4,718的多核苷酸反義。
53.一種分離的多核苷酸，所述多核苷酸包含SEQ ID NO10的核酸序列或其簡并變異體。
54.權(quán)利要求53的多核苷酸，其中SEQ ID NO10的編碼區(qū)包含核苷酸250到1,785。
55.一種RNA分子，所述RNA分子與包含SEQ ID NO10的核酸序列或其簡并變異體的多核苷酸反義。
56.權(quán)利要求55的RNA，其中所述RNA與SEQ ID NO10從約核苷酸1到約核苷酸249或者從約核苷酸1,786到約核苷酸5,386的多核苷酸反義。
57.一種多核苷酸，所述多核苷酸包含可以與SEQ ID NO1或SEQ ID NO1的互補(bǔ)序列在嚴(yán)格性條件下雜交的核酸序列。
58.一種多核苷酸，所述多核苷酸包含可以與SEQ ID NO2或SEQ ID NO2的互補(bǔ)序列在嚴(yán)格性條件下雜交的核酸序列。
59.一種多核苷酸，所述多核苷酸包含可以與SEQ ID NO3或SEQ ID NO3的互補(bǔ)序列在嚴(yán)格性條件下雜交的核酸序列。
60.一種多核苷酸，所述多核苷酸包含可以與SEQ ID NO5或SEQ ID NO5的互補(bǔ)序列在嚴(yán)格性條件下雜交的核酸序列。
61.一種多核苷酸，所述多核苷酸包含可以與SEQ ID NO6或SEQ ID NO6的互補(bǔ)序列在嚴(yán)格性條件下雜交的核酸序列。
62.一種多核苷酸，所述多核苷酸包含可以與SEQ ID NO8或SEQ ID NO8的互補(bǔ)序列在嚴(yán)格性條件下雜交的核酸序列。
63.一種多核苷酸，所述多核苷酸包含可以與SEQ ID NO10或SEQ ID NO10的互補(bǔ)序列在嚴(yán)格性條件下雜交的核酸序列。
64.一種抗體，所述抗體與依照權(quán)利要求25、26、27或28的蛋白選擇性結(jié)合。
65.一種選擇性結(jié)合OM_10多肽的抗體，其中所述抗體結(jié)合包含SEQ ID NO12、SEQ ID NO13、SEQ ID NO14、SEQ ID NO15或SEQ ID NO16的氨基酸序列。
66.一種選擇性結(jié)合OM_10多肽片段的抗體，所述OM_10多肽片段選自SEQ ID NO12、SEQ ID NO13、SEQ ID NO14、SEQ IDNO15和SEQ ID NO16。
67.一種人OM_10多肽，所述人OM_10多肽包含選自以下的一種或多種表位SEQ ID NO12、SEQ ID NO13、SEQ ID NO14、SEQ ID NO15和SEQ ID NO16。
68.一種選擇性結(jié)合UP_11多肽的抗體，其中所述抗體結(jié)合包含SEQ ID NO17、SEQ ID NO18、SEQ ID NO19、SEQ ID NO20或SEQ ID NO21的氨基酸序列。
69.一種選擇性結(jié)合UP_11多肽片段的抗體，所述UP_11多肽片段選自SEQ ID NO17、SEQ ID NO18、SEQ ID NO19、SEQ IDNO20和SEQ ID NO21。
70.一種人UP_11多肽，所述人UP_11多肽包含選自以下的一種或多種表位SEQ ID NO17、SEQ ID NO18、SEQ ID NO19、SEQID NO20和SEQ ID NO21。
71.一種轉(zhuǎn)基因動物，所述轉(zhuǎn)基因動物包含編碼GPCR多肽的多核苷酸，所述GPCR多肽包含選自SEQ ID NO4、SEQ ID NO7、SEQ ID NO9和SEQ ID NO11的氨基酸序列。
72.一種抑制細(xì)胞中GPCR多核苷酸表達(dá)的方法，所述多核苷酸選自SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO5、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8和SEQ ID NO10，所述方法包括給所述細(xì)胞提供與所述多核苷酸反義的核酸分子。
73.一種測定試驗(yàn)化合物對GPCR多肽活性的影響的方法，所述方法包括下述步驟(a)提供轉(zhuǎn)基因動物，所述轉(zhuǎn)基因動物包含編碼GPCR多肽的多核苷酸，所述GPCR多肽具有選自SEQ ID NO4、SEQ ID NO7、SEQID NO9和SEQ ID NO11的氨基酸序列；(b)將一種試驗(yàn)化合物給予所述動物；然后(c)在存在或不存在所述試驗(yàn)化合物的情況下，測定所述試驗(yàn)化合物對GPCR活性的影響。
74.一種測定試驗(yàn)化合物對GPCR多肽活性的影響的方法，所述方法包括下述步驟(a)提供包含GPCR多肽的重組細(xì)胞，所述GPCR多肽具有選自SEQ ID NO4、SEQ ID NO7、SEQ ID NO9和SEQ ID NO11的氨基酸序列；(b)使所述細(xì)胞與一種試驗(yàn)化合物接觸；然后(c)在存在或不存在所述試驗(yàn)化合物的情況下，測定所述試驗(yàn)化合物對所述GPCR活性的影響。
75.一種治療需要增強(qiáng)GPCR活性的受治療者的方法，所述方法包括(a)給予所述受治療者治療有效量的一種所述GPCR受體激動劑；和/或(b)以在體內(nèi)有效產(chǎn)生GPCR活性的方式，給予所述受治療者一種編碼GPCR多肽的多核苷酸，所述GPCR多肽包含選自SEQ IDNO4、SEQ ID NO7、SEQ ID NO9和SEQ ID NO11的氨基酸序列。
76.一種治療需要抑制GPCR活性的受治療者的方法，所述方法包括(a)給予所述受治療者治療有效量的一種GPCR受體拮抗劑；和/或(b)給予所述受治療者一種多核苷酸，所述多核苷酸抑制編碼GPCR多肽的多核苷酸的表達(dá)，所述GPCR多肽包含選自SEQ IDNO4、SEQ ID NO7、SEQ ID NO9和SEQ ID NO11的氨基酸序列；和/或(c)給予所述受治療者治療有效量的一種與GPCR競爭其配體的多肽。
77.一種診斷受治療者的疾病或?qū)膊〉囊赘行缘姆椒?，所述疾病與所述受治療者體內(nèi)的GPCR表達(dá)或活性有關(guān)，所述方法包括(a)測定在編碼GPCR多肽的多核苷酸內(nèi)是否存在突變，所述GPCR多肽包含選自SEQ ID NO4、SEQ ID NO7、SEQ ID NO9和SEQ ID NO11的氨基酸序列；和/或(b)測定來自所述受治療者的樣品中存在GPCR表達(dá)，其中所表達(dá)的GPCR是編碼包含選自SEQ ID NO4、SEQ ID NO7、SEQ IDNO9和SEQ ID NO11的氨基酸序列的GPCR多肽的多核苷酸。
78.一種治療需要抑制GPCR活性的受治療者的方法，所述治療包括給予所述患者治療有效量的一種結(jié)合GPCR多肽胞外部分的抗體，所述GPCR多肽包含選自SEQ ID NO4、SEQ ID NO7、SEQ IDNO9和SEQ ID NO11的氨基酸序列。
79.一種分離的哺乳動物基因，所述哺乳動物基因包含SEQ IDNO1的核酸序列。
80.權(quán)利要求79的基因，其中所述基因編碼包含SEQ ID NO4的氨基酸的UP_11蛋白。
81.一種分離的哺乳動物基因，所述哺乳動物基因包含SEQ IDNO2的核酸序列。
82.權(quán)利要求81的基因，其中所述基因編碼包含SEQ ID NO4的氨基酸的UP_11蛋白。
83.一種分離的哺乳動物基因，所述哺乳動物基因包含SEQ IDNO3的核酸序列。
84.權(quán)利要求83的基因，其中所述基因編碼包含SEQ ID NO4的氨基酸的UP_11蛋白。
85.一種分離的哺乳動物基因，所述哺乳動物基因包含SEQ IDNO5的核酸序列。
86.權(quán)利要求85的基因，其中所述基因編碼包含SEQ ID NO7的氨基酸的UP_11蛋白。
87.一種分離的哺乳動物基因，所述哺乳動物基因包含SEQ IDNO6的核酸序列。
88.權(quán)利要求87的基因，其中所述基因編碼包含SEQ ID NO7的氨基酸的UP_11蛋白。
89.一種分離的哺乳動物基因，所述哺乳動物基因包含SEQ IDNO8的核酸序列。
90.權(quán)利要求89的基因，其中所述基因編碼包含SEQ ID NO9的氨基酸的OM_10蛋白。
91.一種分離的哺乳動物基因，所述哺乳動物基因包含SEQ IDNO10的核酸序列。
92.權(quán)利要求91的基因，其中所述基因編碼包含SEQ ID NO11的氨基酸的OM_10蛋白。
93.一種激活哺乳動物細(xì)胞基因組DNA中內(nèi)源OM_10基因表達(dá)并擴(kuò)增所述基因的方法，其中所述OM_10基因在獲得的所述細(xì)胞中不以顯著水平表達(dá)，所述方法包括下述步驟(a)用包含以下序列的多核苷酸序列轉(zhuǎn)染細(xì)胞(1)通常并不與所獲得的細(xì)胞中所述內(nèi)源OM_10基因功能性連接的外源多核苷酸調(diào)節(jié)序列；(2)與所述細(xì)胞中預(yù)選位點(diǎn)的OM_10基因序列同源的多核苷酸序列；(3)編碼選擇標(biāo)記的可擴(kuò)增多核苷酸序列，由此產(chǎn)生包含所述多核苷酸序列的細(xì)胞；(b)在適于步驟(a)(2)的多核苷酸序列與OM_10基因序列發(fā)生同源重組的條件下，維持步驟(a)中產(chǎn)生的細(xì)胞，由此產(chǎn)生同源重組哺乳動物細(xì)胞，所述同源重組哺乳動物細(xì)胞具有整合到所述OM_10基因中的步驟(a)(1)、(a)(2)和(a)(3)的多核苷酸序列和與所述內(nèi)源基因功能性連接的步驟(a)(1)的外源多核苷酸序列；然后(c)在根據(jù)編碼選擇標(biāo)記的可擴(kuò)增多核苷酸序列的擴(kuò)增進(jìn)行選擇的條件下，培養(yǎng)步驟(b)的細(xì)胞，由此共擴(kuò)增所述可擴(kuò)增多核苷酸序列以及功能性連接步驟(a)(1)的多核苷酸序列的所述內(nèi)源OM_10基因，由此產(chǎn)生同源重組細(xì)胞，所述同源重組細(xì)胞含有編碼選擇標(biāo)記的已擴(kuò)增的多核苷酸序列以及共擴(kuò)增的功能性連接步驟(a)(1)的多核苷酸序列的內(nèi)源OM_10基因，所述同源重組細(xì)胞表達(dá)所述共擴(kuò)增的OM_10基因。
94.一種同源重組細(xì)胞，所述同源重組細(xì)胞按照權(quán)利要求83的方法產(chǎn)生。
95.一種激活哺乳動物細(xì)胞基因組DNA中內(nèi)源UP_11基因表達(dá)并擴(kuò)增所述基因的方法，其中所述UP_11基因在獲得的所述細(xì)胞中不以顯著水平表達(dá)，所述方法包括下述步驟(a)用包含以下序列的多核苷酸序列轉(zhuǎn)染細(xì)胞(1)通常并不與所獲得的細(xì)胞中所述內(nèi)源UP_11基因功能性連接的外源多核苷酸調(diào)節(jié)序列；(2)與所述細(xì)胞中預(yù)選位點(diǎn)的UP_11基因序列同源的多核苷酸序列；(3)編碼選擇標(biāo)記的可擴(kuò)增多核苷酸序列，由此產(chǎn)生包含所述多核苷酸序列的細(xì)胞；(b)在適于步驟(a)(2)的多核苷酸序列與UP_11基因序列發(fā)生同源重組的條件下，維持步驟(a)中產(chǎn)生的細(xì)胞，由此產(chǎn)生同源重組哺乳動物細(xì)胞，所述同源重組哺乳動物細(xì)胞具有整合到所述UP_11基因中的步驟(a)(1)、(a)(2)和(a)(3)的多核苷酸序列和與所述內(nèi)源基因功能性連接的步驟(a)(1)的外源多核苷酸序列；然后(c)在根據(jù)編碼選擇標(biāo)記的可擴(kuò)增多核苷酸序列的擴(kuò)增進(jìn)行選擇的條件下，培養(yǎng)步驟(b)的細(xì)胞，由此共擴(kuò)增所述可擴(kuò)增多核苷酸序列以及有效連接步驟(a)(1)的多核苷酸序列的所述內(nèi)源UP_11基因，由此產(chǎn)生同源重組細(xì)胞，在所述同源重組細(xì)胞包含編碼選擇標(biāo)記的已擴(kuò)增的多核苷酸序列以及共擴(kuò)增的功能性連接步驟(a)(1)的多核苷酸序列的內(nèi)源UP_11基因，所述同源重組細(xì)胞表達(dá)所述共擴(kuò)增的UP_11基因。
96.一種同源重組細(xì)胞，所述同源重組細(xì)胞按照權(quán)利要求96的方法產(chǎn)生。
97.一種為哺乳動物提供OM_10蛋白的方法，所述方法包括將產(chǎn)生所述OM_10蛋白的同源重組細(xì)胞引入所述哺乳動物體內(nèi)，所述同源重組細(xì)胞通過包括下述步驟的方法產(chǎn)生(a)提供一種哺乳動物細(xì)胞，所述哺乳動物細(xì)胞的基因組DNA包含一種內(nèi)源OM_10基因；(b)提供一種DNA構(gòu)建體，所述DNA構(gòu)建體包含所述OM_10基因的一個(gè)打靶序列、一個(gè)外源調(diào)節(jié)序列、一個(gè)外顯子和所述外顯子3′末端的未配對剪接供體位點(diǎn)，其中所述打靶序列與內(nèi)源OM_10基因上游的靶位點(diǎn)同源，所述外源調(diào)節(jié)序列與所述外顯子有效連接；然后(c)用步驟(b)的DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)染步驟(a)的細(xì)胞，由此產(chǎn)生同源重組的細(xì)胞，其中所述剪接供體位點(diǎn)與所述內(nèi)源基因的第二個(gè)外顯子有效連接，并且所述外源調(diào)節(jié)序列控制所述構(gòu)建體衍生的外顯子、所述內(nèi)源OM_10基因和在所述構(gòu)建體衍生的外顯子與所述內(nèi)源OM_10基因之間任何序列的轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)生編碼OM_10蛋白的RNA轉(zhuǎn)錄物。
98.一種為哺乳動物提供UP_11蛋白的方法，所述方法包括將產(chǎn)生所述UP_11蛋白的同源重組細(xì)胞引入所述哺乳動物體內(nèi)，所述同源重組細(xì)胞通過包括下述步驟的方法產(chǎn)生(a)提供一種哺乳動物細(xì)胞，所述哺乳動物細(xì)胞的基因組DNA包含一種內(nèi)源UP_11基因；(b)提供一種DNA構(gòu)建體，所述DNA構(gòu)建體包含所述UP_11基因的一個(gè)打靶序列、一個(gè)外源調(diào)節(jié)序列、一個(gè)外顯子和所述外顯子3′末端的未配對剪接供體位點(diǎn)，其中所述打靶序列與內(nèi)源UP_11基因上游的靶位點(diǎn)同源，所述外源調(diào)節(jié)序列與所述外顯子有效連接；然后(c)用步驟(b)的DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)染步驟(a)的細(xì)胞，由此產(chǎn)生同源重組的細(xì)胞，其中所述剪接供體位點(diǎn)與所述內(nèi)源基因的第二個(gè)外顯子有效連接，并且所述外源調(diào)節(jié)序列控制所述構(gòu)建體衍生的外顯子、所述內(nèi)源UP_11基因和在所述構(gòu)建體衍生的外顯子與所述內(nèi)源UP_11基因之間任何序列的轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)生編碼UP_11蛋白的RNA轉(zhuǎn)錄物。
全文摘要
本發(fā)明總的來講涉及神經(jīng)科學(xué)、生物信息學(xué)和分子生物學(xué)領(lǐng)域。更具體地講，本發(fā)明涉及新鑒定的編碼G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)的多核苷酸、所述多核苷酸和多肽的應(yīng)用、以及所述多核苷酸和多肽的生產(chǎn)。本發(fā)明還涉及鑒定可以作為GPCR的激動劑、拮抗劑和/或抑制劑、并因此可能用于治療的化合物。
文檔編號A61P25/28GK1615439SQ02827078
公開日2005年5月11日 申請日期2002年11月12日 優(yōu)先權(quán)日2001年11月16日
發(fā)明者M·布拉徹爾, J·E·保爾森, B·G·巴特斯 申請人:惠氏公司