專利名稱：一種脫細胞基質(zhì)異種骨的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種脫細胞骨，特別是涉及一種脫細胞基質(zhì)異種骨的制作方法。
背景技術(shù)：
脫細胞組織基質(zhì)是應(yīng)用物理或化學方法將異體或異種組織進行脫細胞處理，從而去除組織移植過程中引起排斥反應(yīng)的相關(guān)抗原，以用于修復損傷組織的一種新型生物材料。隨著社會的飛速發(fā)展，交通運輸、機械化程度的不斷提高，高速、高能量的創(chuàng)傷所導致嚴重的復雜的骨折，常引起骨缺損、骨折不愈合。自體骨移植是最理想的骨移植方法，但由于骨源及供骨部位有限，同時自體組織塑型困難等缺陷，限制了其在臨床的推廣應(yīng)用；同種異體骨移植有傳播人類疾病的危險，有一定的免疫排斥反應(yīng)，使人們應(yīng)用時顧慮重重，同時，來源也有限。目前臨床應(yīng)用的人工骨，成本高、價格昂貴，患者不易接受。脫細胞基質(zhì)異種骨，它取自動物，如豬、牛等，具有來源豐富，易于大量獲取和加工存貯，這些骨組織保留了天然的密集的孔隙結(jié)構(gòu)，具有良好的骨生長支架作用，為細胞的增殖、分化、成骨提供了天然的三維空間結(jié)構(gòu)，具有良好的骨誘導活性及與新骨生長速度相配的降解率，但是，由于異種骨抗原主要存在于骨細胞內(nèi)，必須進行脫細胞的處理，而現(xiàn)有的脫細胞處理方法造成了這些異種骨價格昂貴，從而影響了這些植骨材料的推廣應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)之不足，提供一種脫細胞基質(zhì)異種骨的制作方法，達到消除異種骨內(nèi)的細胞及其抗原性，保留骨里的必須成分的目的，具有成本低，效益明顯，排斥性幾率非常小的特點。
本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是一種脫細胞基質(zhì)異種骨的制作方法，它包括如下步驟；a.去污采用普通洗滌劑將異種骨的骨頭表面的油污等雜質(zhì)洗凈，然后再用蒸餾水沖洗干凈，涼干后獲得完全的骨頭基質(zhì)；b.去蛋白在室溫或37℃烤箱的條件下，將上述去污步驟后獲得的骨頭基質(zhì)放入濃度為15～20％的雙氧水H2O2中浸泡24～48小時，然后再用雙蒸水沖洗至干凈無泡沫為止；c.去酯在室溫條件下，將上述去蛋白步驟后獲得的骨頭基質(zhì)放入1∶1～3∶1的氯仿∶甲醇的混合液中采用持續(xù)震蕩的方式浸泡24～48小時，然后再用雙蒸水循環(huán)沖洗至無氯仿和甲醇的味道為止；d.脫細胞在2～5℃條件下，將上述去酯步驟后獲得的骨頭基質(zhì)放入濃度為0.5～1.0％的十二烷基硫酸鈉SDS和濃度為0.8～1.2％的蛋白酶抑制劑PMSF的混合液中采用攪拌震蕩的方式浸泡24～48小時，然后再用雙蒸水循環(huán)沖洗24～48小時；在2～5℃條件下，再將骨頭基質(zhì)放入濃度為0.1～0.4％的胰蛋白酶中浸泡12～24小時，然后再用雙蒸水循環(huán)沖洗20～28小時，獲得脫細胞基質(zhì)異種骨；e.殺菌消毒、包裝采用凍干機凍干的方式將脫細胞基質(zhì)異種骨凍干，然后進行封裝，采用環(huán)氧乙烷或Co60進行殺菌消毒。
本發(fā)明的一種脫細胞基質(zhì)異種骨的制作方法，所采用的雙氧水H2O2的濃度不宜過濃，若超過20％，容易破壞骨頭的強度。
本發(fā)明的一種脫細胞基質(zhì)異種骨的制作方法，在去酯步驟中，采用了持續(xù)震蕩的方式，可以通過完全的混合，達到更好的去酯效果。
本發(fā)明的一種脫細胞基質(zhì)異種骨的制作方法，在脫細胞步驟中，采用了十二烷基硫酸鈉SDS和蛋白酶抑制劑PMSF，十二烷基硫酸鈉是一種常用的陰離子表面活性劑，具有很強的去污力，它的泡沫很豐富，從感官上也給人以很強的去污力；蛋白酶抑制劑本身為固體，需利用丙酮酸進行溶解；在脫細胞的過程中，是采用了低滲的方法使細胞脹破，從而破壞了細胞膜結(jié)構(gòu)，只保留細胞外基質(zhì)。該方法可以防止細胞在低滲條件下脹破后，釋放細胞內(nèi)蛋白酶類，分解細胞外基質(zhì)蛋白，因而基本保留了細胞外基質(zhì)的有機和無機成份，而去除了細胞的成份，在去除細胞膜結(jié)構(gòu)的同時也去除了膜上的抗原成分，減少了抗原性。實現(xiàn)了在完全保留骨的有機成分和無機成分情況下，使細胞完全脫出。
本發(fā)明的一種脫細胞基質(zhì)異種骨的制作方法，在脫細胞過程中要選擇低溫條件下進行，這樣，才能防止在骨頭的處理過程中出現(xiàn)骨頭腐壞的現(xiàn)象發(fā)生。
本發(fā)明的有益效果是，由于采用了普通洗滌劑去污蒸餾水沖洗、雙氧水H2O2去蛋白雙蒸水沖洗、氯仿、甲醇混合液去酯雙蒸水循環(huán)沖洗、十二烷基硫酸鈉SDS、蛋白酶抑制劑PMSF及胰蛋白酶脫細胞雙蒸水循環(huán)沖洗、環(huán)氧乙烷或Co60殺菌消毒等過程來處理異種骨，使異種骨在完全保留骨的有機成分和無機成分情況下，細胞完全脫出，從而獲得了脫細胞基質(zhì)異種骨；該脫細胞基質(zhì)異種骨排斥性幾率非常小，植入后對受體的全身及局部免疫無明顯影響，具有較好的相容性及骨傳導性；該方法具有原料來源豐富、制作成本低，效益明顯的優(yōu)點，與市場同類產(chǎn)品相比更具有競爭力。
以下結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步詳細說明；但本發(fā)明的一種脫細胞基質(zhì)異種骨的制作方法不局限于實施例。
具體實施例方式
實施例一，本發(fā)明的一種脫細胞基質(zhì)異種骨的制作方法，它采用如下步驟制作而成第一步，去污采用普通洗滌劑將異種骨的骨頭表面的油污等雜質(zhì)洗凈，然后再用蒸餾水沖洗干凈，涼干后獲得完全的骨頭基質(zhì)。
第二步，去蛋白在室溫或37℃烤箱的條件下，將上述去污步驟后獲得的骨頭基質(zhì)放入濃度為18％的雙氧水H2O2中浸泡35小時，然后再用雙蒸水沖洗至干凈無泡沫為止；所采用的雙氧水H2O2的濃度不宜過濃，若超過20％，容易破壞骨頭的強度。
第三步，去酯在室溫如25℃條件下，將上述去蛋白步驟后獲得的骨頭基質(zhì)放入2∶1的氯仿∶甲醇的混合液中采用持續(xù)震蕩的方式浸泡35小時，然后再用雙蒸水循環(huán)沖洗至無氯仿和甲醇的味道為止；在該步驟中，采用了持續(xù)震蕩的方式，可以通過氯仿、甲醇的完全混合，達到更好的去酯效果。
第四步，脫細胞在4℃條件下，將上述去酯步驟后獲得的骨頭基質(zhì)放入濃度為0.5％的十二烷基硫酸鈉SDS和濃度為1％的蛋白酶抑制劑PMSF的混合液中采用攪拌震蕩的方式浸泡35小時，然后再用雙蒸水循環(huán)沖洗24小時；在4℃條件下，再將骨頭基質(zhì)放入濃度為0.25％的胰蛋白酶中浸泡18小時，然后再用雙蒸水循環(huán)沖洗24小時，獲得脫細胞基質(zhì)異種骨。
第五步，殺菌消毒、包裝采用凍干機凍干的方式將脫細胞基質(zhì)異種骨凍干，然后進行封裝，采用環(huán)氧乙烷或Co60進行殺菌消毒。
本發(fā)明的一種脫細胞基質(zhì)異種骨的制作方法，在脫細胞步驟中，采用了十二烷基硫酸鈉SDS和蛋白酶抑制劑PMSF，十二烷基硫酸鈉是一種常用的陰離子表面活性劑，具有很強的去污力，它的泡沫很豐富，從感官上也給人以很強的去污力；蛋白酶抑制劑本身為固體，需利用丙酮酸進行溶解；在脫細胞的過程中，是采用了低滲的方法使細胞脹破，從而破壞了細胞膜結(jié)構(gòu)，只保留細胞外基質(zhì)。該方法可以防止細胞在低滲條件下脹破后，釋放細胞內(nèi)蛋白酶類，分解細胞外基質(zhì)蛋白，因而基本保留了細胞外基質(zhì)的有機和無機成份，而去除了細胞的成份，在去除細胞膜結(jié)構(gòu)的同時也去除了膜上的抗原成分，減少了抗原性。實現(xiàn)了在完全保留骨的有機成分和無機成分情況下，使細胞完全脫出。
本發(fā)明的一種脫細胞基質(zhì)異種骨的制作方法，在脫細胞過程中要選擇低溫條件下進行，這樣，才能防止在骨頭的處理過程中出現(xiàn)骨頭腐壞的現(xiàn)象發(fā)生。
實施例二，本發(fā)明的一種脫細胞基質(zhì)異種骨的制作方法，它采用如下步驟制作而成第一步，去污采用普通洗滌劑將異種骨的骨頭表面的油污等雜質(zhì)洗凈，然后再用蒸餾水沖洗干凈，涼干后獲得完全的骨頭基質(zhì)。
第二步，去蛋白在室溫或37℃烤箱的條件下，將上述去污步驟后獲得的骨頭基質(zhì)放入濃度為15％的雙氧水H2O2中浸泡48小時，然后再用雙蒸水沖洗至干凈無泡沫為止。
第三步，去酯在室溫如25℃條件下，將上述去蛋白步驟后獲得的骨頭基質(zhì)放入1∶1的氯仿∶甲醇的混合液中采用持續(xù)震蕩的方式浸泡48小時，然后再用雙蒸水循環(huán)沖洗至無氯仿和甲醇的味道為止。
第四步，脫細胞在2℃條件下，將上述去酯步驟后獲得的骨頭基質(zhì)放入濃度為0.85％的十二烷基硫酸鈉SDS和濃度為0.8％的蛋白酶抑制劑PMSF的混合液中采用攪拌震蕩的方式浸泡24小時，然后再用雙蒸水循環(huán)沖洗35小時；在5℃條件下，再將骨頭基質(zhì)放入濃度為0.1％的胰蛋白酶中浸泡12小時，然后再用雙蒸水循環(huán)沖洗20小時，獲得脫細胞基質(zhì)異種骨。
第五步，殺菌消毒、包裝采用凍干機凍干的方式將脫細胞基質(zhì)異種骨凍干，然后進行封裝，采用環(huán)氧乙烷或Co60進行殺菌消毒。
實施例三，本發(fā)明的一種脫細胞基質(zhì)異種骨的制作方法，它采用如下步驟制作而成第一步，去污采用普通洗滌劑將異種骨的骨頭表面的油污等雜質(zhì)洗凈，然后再用蒸餾水沖洗干凈，涼干后獲得完全的骨頭基質(zhì)。
第二步，去蛋白在室溫或37℃烤箱的條件下，將上述去污步驟后獲得的骨頭基質(zhì)放入濃度為20％的雙氧水H2O2中浸泡24小時，然后再用雙蒸水沖洗至干凈無泡沫為止。
第三步，去酯在室溫如25℃條件下，將上述去蛋白步驟后獲得的骨頭基質(zhì)放入3∶1的氯仿∶甲醇的混合液中采用持續(xù)震蕩的方式浸泡24小時，然后再用雙蒸水循環(huán)沖洗至無氯仿和甲醇的味道為止。
第四步，脫細胞在5℃條件下，將上述去酯步驟后獲得的骨頭基質(zhì)放入濃度為1.0％的十二烷基硫酸鈉SDS和濃度為1.2％的蛋白酶抑制劑PMSF的混合液中采用攪拌震蕩的方式浸泡48小時，然后再用雙蒸水循環(huán)沖洗48小時；在2℃條件下，再將骨頭基質(zhì)放入濃度為0.4％的胰蛋白酶中浸泡24小時，然后再用雙蒸水循環(huán)沖洗28小時，獲得脫細胞基質(zhì)異種骨。
第五步，殺菌消毒、包裝采用凍干機凍干的方式將脫細胞基質(zhì)異種骨凍干，然后進行封裝，采用環(huán)氧乙烷或Co60進行殺菌消毒。
權(quán)利要求
1.一種脫細胞基質(zhì)異種骨的制作方法，其特征在于它包括如下步驟；a.去污采用普通洗滌劑將異種骨的骨頭表面的油污等雜質(zhì)洗凈，然后再用蒸餾水沖洗干凈，涼干后獲得完全的骨頭基質(zhì)；b.去蛋白在室溫或37℃烤箱的條件下，將上述去污步驟后獲得的骨頭基質(zhì)放入濃度為15～20％的雙氧水H2O2中浸泡24～48小時，然后再用雙蒸水沖洗至干凈無泡沫為止；c.去酯在室溫條件下，將上述去蛋白步驟后獲得的骨頭基質(zhì)放入1∶1～3∶1的氯仿∶甲醇的混合液中采用持續(xù)震蕩的方式浸泡24～48小時，然后再用雙蒸水循環(huán)沖洗至無氯仿和甲醇的味道為止；d.脫細胞在2～5℃條件下，將上述去酯步驟后獲得的骨頭基質(zhì)放入濃度為0.5～1.0％的十二烷基硫酸鈉SDS和濃度為0.8～1.2％的蛋白酶抑制劑PMSF的混合液中采用攪拌震蕩的方式浸泡24～48小時，然后再用雙蒸水循環(huán)沖洗24～48小時；在2～5℃條件下，再將骨頭基質(zhì)放入濃度為0.1～0.4％的胰蛋白酶中浸泡12～24小時，然后再用雙蒸水循環(huán)沖洗20～28小時，獲得脫細胞基質(zhì)異種骨；e.殺菌消毒、包裝采用凍干機凍干的方式將脫細胞基質(zhì)異種骨凍干，然后進行封裝，采用環(huán)氧乙烷或Co60進行殺菌消毒。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種脫細胞基質(zhì)異種骨的制作方法，它包括普通洗滌劑去污蒸餾水沖洗、雙氧水H
文檔編號A61F2/28GK1903382SQ20051004433
公開日2007年1月31日 申請日期2005年7月29日 優(yōu)先權(quán)日2005年7月29日
發(fā)明者芮鋼, 王者生, 高景恒 申請人:芮鋼