專利名稱：組織工程支架用多孔材料及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)材料領(lǐng)域，特別涉及一種適用于組織工程支架的多孔材料及其制備方法。
背景技術(shù)：
目前已開(kāi)發(fā)應(yīng)用于組織工程的生物可降解多孔材料，主要有聚乳酸(PLA)、聚羥基乙酸(PGA)和膠原蛋白等。但合成材料(PLA、PGA等)在生物相容性、理化性能、降解速率的控制及緩釋性等方面尚有許多問(wèn)題未得到解決，且合成工藝較復(fù)雜。天然材料中的膠原蛋白雖然自身就包含著許多生物信息，能夠使細(xì)胞維持或產(chǎn)生許多功能，但特定種類的膠原蛋白提純工作較煩瑣，質(zhì)量控制較困難，且能否完全避免抗原的影響和疾病的傳播尚待觀察。
研究表明，蠶絲中含有約75％的絲素和25％的絲膠，它們是蠶在絹絲腺內(nèi)分泌出的天然蛋白質(zhì)，由18種氨基酸殘基所組成，各項(xiàng)試驗(yàn)結(jié)果顯示，蠶絲蛋白無(wú)毒性、無(wú)刺激性，具有良好的生物相容性，是制造生物醫(yī)用材料的較理想原料。在本發(fā)明作出之前，中國(guó)專利CN1260363A“一種多孔絲素膜及其制備方法”公開(kāi)了一種以家蠶絲素蛋白為原料，采用冷凍干燥法制備多孔絲素膜的技術(shù)。該方法是先將家蠶絲經(jīng)脫膠、溶解、透析、提純后得到純絲素蛋白溶液；在上述溶液中加入添加劑，其中含10～60％的CH2CH(OH)CH2OH等、10～60％的CH3CH2(OH)CH(NH2)COOH等，其余為環(huán)氧化物等作為交聯(lián)劑，制成制備用混合溶液，將其注入到模具內(nèi)，在-4～-85℃的溫度下冷凍10min～24h，再進(jìn)行真空干燥，真空干燥的前5～24h溫度設(shè)定在-4～-40℃范圍內(nèi)，其后的真空干燥過(guò)程中，每小時(shí)升溫1～10℃至室溫，即可得到該發(fā)明所述的絲素蛋白多孔膜。從結(jié)構(gòu)上來(lái)看，由于絲素為纖維狀蛋白，因此，用絲素制備的多孔膜在作為組織工程支架材料使用時(shí)，其生物降解的速度較慢。當(dāng)組織再生速度較快時(shí)，要求支架材料較快地被降解吸收，否則可能影響新生組織的形態(tài)和功能，而當(dāng)組織再生速度較慢時(shí)，支架材料應(yīng)該具有積極引導(dǎo)、促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)成規(guī)范組織的能力，從而加快組織修復(fù)速度，此時(shí)，支架材料被降解吸收的速度也需同時(shí)加快，以便與組織再生速度相適應(yīng)，因此，單純用絲素制備的多孔材料，其生物降解速度就很難適應(yīng)組織再生速度。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是針對(duì)已有技術(shù)的不足，提供一種可控制生物降解速度、并能促進(jìn)細(xì)胞粘附和生長(zhǎng)的組織工程支架用多孔材料及其制備方法。
本發(fā)明所述的組織工程支架用多孔材料，是含有家蠶絲素蛋白的塊狀或膜狀物，內(nèi)部平均孔密度為1～3000個(gè)/mm2，平均孔徑為1～500μm，其特征在于它還含有家蠶絲膠蛋白、柞蠶絲素蛋白；孔內(nèi)含有以絲膠蛋白為壁材的細(xì)胞生長(zhǎng)因子緩釋微膠囊。
制備本發(fā)明所述的組織工程支架用多孔材料的方法，將家蠶絲脫膠、溶解、提純后得到家蠶絲素水溶液，在濃縮的絲素溶液中加入添加劑后成為制備用混合原液，將該原液冷凍干燥，其特征在于還包括如下步驟(1)制備家蠶絲膠蛋白、柞蠶絲素蛋白加入到制備用混合原液中，在30～90℃溫度條件下以大于500轉(zhuǎn)/分的速度攪拌均勻后，立即在-15～-85℃溫度條件下冷凍，再經(jīng)冷凍干燥后制成蠶絲蛋白多孔體；(2)制備以絲膠蛋白為壁材的細(xì)胞生長(zhǎng)因子緩釋微膠囊，注入上述多孔體的孔內(nèi)制成組織工程支架用蠶絲蛋白多孔材料。
以上所述的柞蠶絲素蛋白制備方法是用濃度為5～12M的硫氰化鋰，浴比為1∶5～1∶500，在20～100℃的溫度條件下溶解柞蠶絲素纖維，經(jīng)透析后制得分子量為0.35～1.50萬(wàn)的柞蠶絲素蛋白水溶液。
以上所述的制備以絲膠蛋白為壁材的細(xì)胞生長(zhǎng)因子緩釋微膠囊的方法是(1)將濃度為0.01～0.20g/ml的絲膠水溶液預(yù)熱至40～80℃，逐滴滴入已預(yù)熱至40～80℃的植物油中，邊滴邊以200～2000轉(zhuǎn)/分的速度攪拌，冷卻后以100～1500轉(zhuǎn)/分的速度攪拌待絲膠凝膠；再在上述溶液中加入有機(jī)溶劑，經(jīng)離心分離、交聯(lián)、干燥后得到絲膠蛋白微球；(2)將細(xì)胞生長(zhǎng)因子溶液滴入干燥的絲膠蛋白微球，制得以絲膠蛋白為壁材的細(xì)胞生長(zhǎng)因子緩釋微膠囊。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明所述的組織工程用多孔材料具有以下顯著優(yōu)點(diǎn)
(1)柞蠶絲素蛋白的一級(jí)結(jié)構(gòu)中含Arg-Gly-Asp序列等生物信息，與細(xì)胞有特異相互作用，故在多孔材料中加入了柞蠶絲素蛋白后能促進(jìn)細(xì)胞的粘附；(2)多孔材料內(nèi)注入了細(xì)胞生長(zhǎng)因子緩釋微膠囊，所以，能引導(dǎo)、促進(jìn)細(xì)胞沿支架增殖、生長(zhǎng)；(3)絲膠蛋白為球狀結(jié)構(gòu)，較易被生物降解，因而，可通過(guò)調(diào)節(jié)材料內(nèi)絲膠與絲素蛋白的質(zhì)量比，來(lái)實(shí)現(xiàn)控制其降解速度與新生組織的再生速度相適應(yīng)的目的。
(4)由于采用了對(duì)制備用混合原液快速攪拌、快速冷凍的方法，使溶液中無(wú)規(guī)線團(tuán)結(jié)構(gòu)的絲素、絲膠大分子充分伸展，混合均勻，并將此狀態(tài)快速固定，解決了蠶絲蛋白多孔材料內(nèi)絲素相與絲膠相分離的問(wèn)題，使材料的形態(tài)、結(jié)構(gòu)和性能均勻化。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例一1.家蠶繭經(jīng)剝繭、切剖、去蛹得到繭層，將1公斤清潔的家蠶繭層用自來(lái)水充分洗滌后，再用去離子水洗滌3次，放入20升去離子水中，于98～100℃處理40分鐘使絲膠溶解，過(guò)濾后得到濃度為1.5％絲膠水溶液，并取部分絲膠水溶液冷凍干燥后得到固體絲膠。
2.將1公斤家蠶絲放入10升濃度為0.025％的碳酸鈉水溶液中，煮沸0.5小時(shí)，重復(fù)處理三次，脫盡蠶絲外圍的絲膠，得到純絲素纖維；將晾干后的絲素纖維，用10升摩爾比為1∶8∶2的氯化鈣、水、乙醇溶液，在78±2℃下加熱溶解成絲素蛋白混合溶液；用纖維素膜為透析材料，將所得的絲素蛋白混合溶液用水進(jìn)行透析，以去除氯化鈣，乙醇等雜質(zhì)，再用多層脫脂紗布過(guò)濾，得到純的絲素蛋白溶液；純絲素溶液維持在35℃下，邊攪拌邊使其蒸發(fā)濃縮。
3.向鋁合金模具內(nèi)注入濃度為3％的添加劑，在-16℃下預(yù)凍2小時(shí)。
4.將絲膠水溶液、絲素水溶液按80∶20的比例混合，加入添加劑后制成制備用混合原液，將該混合原液在75±2℃的溫度條件下以1700轉(zhuǎn)/分的速度攪拌均勻后，立即注入上述鋁合金模具內(nèi)，厚度為10mm，于-16℃溫度下快速冷凍2小時(shí)。
5.將上述冷凍體連同模具，置于冷凍干燥機(jī)內(nèi)減壓干燥，干燥過(guò)程的前24小時(shí)，溫度恒定于-16℃，其后每小時(shí)升溫2℃直至室溫，干燥完成后從鋁合金模具內(nèi)取出即為塊狀的家蠶絲蛋白多孔體。
6.制備濃度為0.025g/ml的絲膠水溶液，預(yù)熱至70℃后，逐滴滴入2000ml已預(yù)熱至70℃的橄欖油中，邊滴邊以1000轉(zhuǎn)/分的速度攪拌15分鐘，溫度維持在70℃，得到油包水乳液。將乳液冷卻至30℃，以300轉(zhuǎn)/分的速度攪拌60分鐘，使絲膠凝膠化。在上述溶液中加入700ml丙酮，繼續(xù)以300轉(zhuǎn)/分的速度攪拌60分鐘，離心分離，用異丙醇洗滌，在濃度為1％的戊二醛溶液中浸漬1小時(shí)使其交聯(lián)，冷凍干燥后得到絲膠蛋白微球。將堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子bFGF溶液滴入干燥的絲膠蛋白微球，室溫放置60分鐘，使bFGF滲入微球內(nèi)，制得以絲膠蛋白為壁材的bFGF緩釋微膠囊。
7.適量的生理鹽水使bFGF緩釋微膠囊膨潤(rùn)后，注入家蠶絲蛋白多孔體內(nèi)，制得含bFGF緩釋微膠囊的家蠶絲蛋白多孔材料。
在本實(shí)施例的制備用混合原液中，也可加入適量的柞蠶絲素蛋白溶液(柞蠶絲素蛋白溶液的制備方法參見(jiàn)實(shí)施例二步驟1、2)。柞蠶絲素、家蠶絲膠、家蠶絲素三者可以任意比例混合后制成制備用混合原液，其比例可根據(jù)該多孔材料用于組織工程支架時(shí)所要求的對(duì)細(xì)胞的粘附性、降解速度及物理性能來(lái)決定。柞蠶絲素蛋白的比例越高，材料對(duì)細(xì)胞的粘附性越好；絲膠蛋白的比例越高，生物降解速度越快；家蠶絲素蛋白的比例越高，材料的形態(tài)穩(wěn)定性等物理性能越好。因此，改變多孔材料內(nèi)絲膠、柞蠶絲素、家蠶絲素的比例，可達(dá)到控制其生物降解速度、對(duì)細(xì)胞的粘附性及材料的物理性能的目的，使其適應(yīng)于不同組織再生的需要。按本實(shí)施例方法制備的蠶絲蛋白多孔材料，其主要結(jié)構(gòu)、性能見(jiàn)表一。
實(shí)施例二1.將0.5公斤中國(guó)柞蠶絲放入10升濃度為0.5％的碳酸鈉水溶液中，煮沸0.5小時(shí)，重復(fù)處理三次，脫盡柞蠶絲外圍的絲膠，得到柞蠶絲素纖維。
2.用濃度為9M的硫氰化鋰，于溫度40℃，浴比1∶20溶解柞蠶絲得到混合溶液；將上述溶液對(duì)水透析4晝夜，透析材料為截留分子量為1.10萬(wàn)的纖維素膜，得到純柞蠶絲素蛋白水溶液；將上述純柞蠶絲素溶液維持在40℃下，邊攪拌邊進(jìn)行蒸發(fā)濃縮，使溶液含固率達(dá)到10.0％。
3.0.5公斤清潔的繭層用水充分洗滌后，放入12升去離子水中，于98～100℃溫度條件下處理60分鐘，使絲膠溶解，過(guò)濾后得到濃度為絲膠水溶液。
4.向不銹鋼模具內(nèi)注入濃度為1.5％的添加劑，在-40℃下預(yù)凍6小時(shí)。
5.將濃縮的柞蠶絲素溶液與絲膠水溶液按50∶50的比例混合，加入添加劑后制成制備用混合原液，使混合溶液的溫度維持在40±2℃的同時(shí)，以1000轉(zhuǎn)/分的速度快速攪拌溶液60分鐘，隨后注入上述不銹鋼模具內(nèi)，厚度為0.5mm，于-40℃溫度下快速冷凍6小時(shí)。
6.將上述冷凍體連同不銹鋼模具，置于冷凍干燥機(jī)內(nèi)真空干燥，干燥過(guò)程的前18小時(shí)，溫度恒定于-20℃，其后每小時(shí)升溫2℃，直至室溫，取出即為膜狀的蠶絲蛋白多孔體。
7.制備濃度為0.05g/ml的絲膠水溶液，將其預(yù)熱至60℃后，逐滴滴入已預(yù)熱至60℃的橄欖油中，邊滴邊以400轉(zhuǎn)/分的速度攪拌15分鐘，溫度維持在60℃，得到油包水乳液。將該水乳液冷卻至20℃，以250轉(zhuǎn)/分的速度攪拌60分鐘，使絲膠凝膠化。在上述溶液中加入500ml丙酮，繼續(xù)以250轉(zhuǎn)/分的速度攪拌60分鐘，離心分離，用異丙醇洗滌8次，在濃度為75％的乙醇溶液中浸漬1小時(shí)使其交聯(lián)，冷凍干燥后得到絲膠蛋白微球。將堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子bFGF溶液滴入干燥的絲膠蛋白微球，室溫放置60分鐘，使bFGF滲入微球內(nèi)，制得以絲膠蛋白為壁材的bFGF緩釋微膠囊。
8.適量的生理鹽水使bFGF緩釋微膠囊膨潤(rùn)后，注入蠶絲蛋白多孔膜內(nèi)，制得含bFGF緩釋微膠囊的蠶絲蛋白多孔材料。
在本實(shí)施例的制備用混合原液中，也可根據(jù)需要按比例加入如實(shí)施例一的方法制備的家蠶絲素蛋白。按本實(shí)施例方法制備的蠶絲蛋白多孔膜的主要結(jié)構(gòu)、性能見(jiàn)表二。
表一 家蠶絲蛋白多孔材料的主要結(jié)構(gòu)、性能

表二柞蠶絲蛋白多孔材料的主要結(jié)構(gòu)、性能

權(quán)利要求
1.一種組織工程支架用多孔材料，是含有家蠶絲素蛋白的塊狀或膜狀物，內(nèi)部平均孔密度為1～3000個(gè)/mm2，平均孔徑為1～500μm，其特征在于它還含有家蠶絲膠蛋白、柞蠶絲素蛋白；孔內(nèi)含有以絲膠蛋白為壁材的細(xì)胞生長(zhǎng)因子緩釋微膠囊。
2.一種制備組織工程支架用多孔材料的方法，將家蠶絲脫膠、溶解、提純后得到家蠶絲素水溶液，在濃縮的絲素溶液中加入添加劑后成為制備用混合原液，將該原液冷凍干燥，其特征在于還包括如下步驟(1)制備家蠶絲膠蛋白、柞蠶絲素蛋白加入到制備用混合原液中，在30～90℃溫度條件下以大于500轉(zhuǎn)/分的速度攪拌均勻后，立即在-15～-85℃溫度條件下冷凍，再經(jīng)冷凍干燥后制成蠶絲蛋白多孔體；(2)制備以絲膠蛋白為壁材的細(xì)胞生長(zhǎng)因子緩釋微膠囊，注入上述多孔體的孔內(nèi)，制成組織工程支架用蠶絲蛋白多孔材料。
3.如權(quán)利要求2所述的一種制備組織工程支架用多孔材料的方法，其特征在于所述的柞蠶絲素蛋白制備方法是用濃度為5～12M的硫氰化鋰，浴比為1∶5～1∶500，在20～100℃的溫度條件下溶解柞蠶絲素纖維，經(jīng)透析后制得分子量為0.35～1.50萬(wàn)的柞蠶絲素蛋白水溶液。
4.如權(quán)利要求2所述的一種制備組織工程支架用多孔材料的方法，其特征在于所述的制備以絲膠蛋白為壁材的細(xì)胞生長(zhǎng)因子緩釋微膠囊的方法是(1)將濃度為0.01～0.20g/ml的絲膠水溶液預(yù)熱至40～80℃，逐滴滴入已預(yù)熱至40～80℃的植物油中，邊滴邊以200～2000轉(zhuǎn)/分的速度攪拌，冷卻后以100～1500轉(zhuǎn)/分的速度攪拌待絲膠凝膠；再在上述溶液中加入有機(jī)溶劑，經(jīng)離心分離、交聯(lián)、干燥后得到絲膠蛋白微球；(2)將細(xì)胞生長(zhǎng)因子溶液滴入干燥的絲膠蛋白微球，制得以絲膠蛋白為壁材的細(xì)胞生長(zhǎng)因子緩釋微膠囊。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)材料領(lǐng)域，特別涉及一種組織工程支架用多孔材料及其制備方法。它以從家蠶絲、柞蠶絲中分別溶解、提純得到的絲膠和絲素為主要原料，按適當(dāng)比例混合、在一定溫度下快速攪拌、冷凍后，采用冷凍干燥法加工成塊狀或膜狀多孔體，并在其孔內(nèi)注入細(xì)胞生長(zhǎng)因子緩釋微膠囊。它不僅具備良好的生物相容性，還能引導(dǎo)、促進(jìn)細(xì)胞的粘附和生長(zhǎng)，可調(diào)節(jié)生物降解速度，適用于細(xì)胞培養(yǎng)基質(zhì)及皮膚、硬腦膜、軟骨等組織修復(fù)材料。
文檔編號(hào)A61L27/22GK1397354SQ02138129
公開(kāi)日2003年2月19日 申請(qǐng)日期2002年8月14日 優(yōu)先權(quán)日2002年8月14日
發(fā)明者李明忠, 吳徵宇 申請(qǐng)人:蘇州大學(xué)