專利名稱：一種八角茴香殺線蟲提取物及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種八角茴香殺線蟲提取物及其制備方法。
背景技術(shù)：
根結(jié)線蟲(Meloidogyne spp.)為植物根系專性寄生物，是當(dāng)前影響農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的一類重要病原物。從20世紀(jì)80年代開(kāi)始，利用植物提取液防治線蟲的研究逐漸引起人們的重視，至今已報(bào)道的殺線蟲植物約有102科226屬316種，其中研究較多的有菊科、楝科、豆科、十字花科、茄科、禾本科、大戟科、罌粟科、夾竹桃科、含羞草科、百合科等，但自然界植物資源極為豐富，許多具有殺線蟲作用的植物還未被發(fā)現(xiàn)，《中國(guó)有毒植物》一書列入有毒植物1300 多種，其中，許多種類都具有殺蟲活性。且很多植物都可以就地取材，應(yīng)用方便，效果明顯， 因此，目前國(guó)內(nèi)對(duì)殺線蟲植物資源的篩選及毒殺活性測(cè)定等方面有較多研究，充分調(diào)查和挖掘出更多更有效的新殺線蟲植物種類將成為未來(lái)發(fā)展的方向。八角茴香為木蘭科八角茴香植物(Illicium verum)的果實(shí)。秋季采收，曬干入藥。 《全國(guó)中草藥匯編》描述其果實(shí)含揮發(fā)油4 9%，一般約為5%、脂肪油約22%及蛋白質(zhì)、 樹(shù)膠和樹(shù)脂等。揮發(fā)油中主要成份為茴香醚(anethole)約80 90%，其余為α-萜品醇、 d-菔烯及少量甲基胡椒酚(methyl chavicol)等。其活性成分在人類醫(yī)學(xué)上應(yīng)用較多，八角茴香的乙醇提取物對(duì)金黃色葡萄球菌、霍亂弧菌、傷寒桿菌、肺炎球菌、白喉?xiàng)U菌、痢疾桿菌、大腸桿菌及一些常見(jiàn)致病性皮膚真菌均有較強(qiáng)的抑制作用。在植物醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用，只有防治貯糧害蟲和農(nóng)業(yè)害蟲小菜蛾的少量研究報(bào)道，在植物根結(jié)線蟲病防治上未見(jiàn)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種制備八角茴香無(wú)水乙醇提取物的方法。本發(fā)明提供的方法，包括如下步驟1)將八角茴香與無(wú)水乙醇混勻，得到混合物；2)將步驟1)得到的混合物進(jìn)行超聲處理，即得到八角茴香無(wú)水乙醇提取物。所述八角茴香為八角茴香的果實(shí)。步驟1)中，所述八角茴香與無(wú)水乙醇的配比為IOg (45-55)ml ；步驟2)中，所述超聲的功率為300-500W，所述超聲的工作頻率為28KHz_100KHz， 所述超聲的時(shí)間為25min-35min ；所述超聲的溫度為23°C _28°C。步驟1)中，所述八角茴香與無(wú)水乙醇的配比為IOg (45,50或55)ml ；步驟2)中，所述超聲的功率為300W、400W或500W，所述超聲的工作頻率為28KHz、 45KHz或IOOKHz，所述超聲的時(shí)間為25min、30min或35min ；所述超聲的溫度為23°C、25°C 或 28°C。在步驟1)前，還包括將所述八角茴香粉碎至35目-45目大小的步驟；所述八角茴香粉碎至具體為35目、40目或45目大?。?br> 在步驟2)后，還包括如下步驟將所述超聲處理得到的超聲產(chǎn)物依次經(jīng)抽濾、濾液濃縮至膏狀，得到八角茴香無(wú)水乙醇提取物。由所述的方法制備的八角茴香無(wú)水乙醇提取物也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。所述的八角茴香無(wú)水乙醇提取物在殺線蟲和/或防線蟲中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。所述的八角茴香無(wú)水乙醇提取物在制備線蟲的生防制劑中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。所述線蟲為根結(jié)線蟲(Meloidogyne spp.)。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種線蟲的生防制劑。本發(fā)明提供的生防制劑，其活性成分為所述的八角茴香無(wú)水乙醇提取物。所述線蟲為根結(jié)線蟲(Meloidogyne spp.)。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明采用無(wú)水乙醇對(duì)八角茴香進(jìn)行提取，并將提取液對(duì)根結(jié)線蟲的毒殺效果測(cè)試，結(jié)果為該提取物對(duì)根結(jié)線蟲有強(qiáng)的毒殺活性；說(shuō)明本發(fā)明的提取物為今后根結(jié)線蟲生防制劑的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。實(shí)施例1、八角茴香無(wú)水乙醇提取物的獲得高速粉碎機(jī)，6202型，北京環(huán)亞天元機(jī)械技術(shù)有限公司制造；臺(tái)式三頻數(shù)控超聲波清洗器，KQ-500VDV型，昆山市超聲儀器有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，RE-2000型，上海亞榮生化儀器廠；體視顯微鏡，Motic SMZ-140型，麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司；微量可調(diào)移液器，GILS0N，法國(guó)；96孔一次性細(xì)胞培養(yǎng)板，JET BIOFIL 型，加拿大；電熱恒溫培養(yǎng)箱， SKP-02. 420型，黃石市恒豐醫(yī)療器械有限公司；無(wú)水乙醇(分析純)，北京化工廠；供試的八角茴香(Illicium verum)購(gòu)自北京市同仁堂大藥房，屬于木蘭科，使用果實(shí)。供試根結(jié)線蟲(Meloidogyne spp.)從田間發(fā)病地塊采集番茄根結(jié)線蟲病的病根， 按照馬喆等人(兩種農(nóng)藥對(duì)南方根結(jié)線蟲的室內(nèi)毒力測(cè)定，北京農(nóng)學(xué)院學(xué)報(bào)，2009，24(3) 17-19)介紹的方法，通過(guò)從病根上挑去卵囊和孵化獲得。1、根結(jié)線蟲二齡幼蟲懸浮液的制備從田間采集番茄根結(jié)線蟲病的病根，取產(chǎn)生大量根結(jié)的番茄根系，自來(lái)水輕輕沖洗干凈，用解剖針輕輕挑取病根上的乳白色卵囊，放入直徑6cm的小培養(yǎng)皿內(nèi)，加入少量無(wú)菌水，在25°C恒溫箱中孵化3d，收集2齡幼蟲(簡(jiǎn)稱J2)，并加入一定量的無(wú)菌水將其配制成一定濃度(500條/mL)的根結(jié)線蟲二齡幼蟲懸浮液備用。2、植物提取物的制備方法一1)粉碎將干燥的八角茴香放入高速粉碎機(jī)粉碎后過(guò)40目篩，放入密封袋中備用。2)提取
采用超聲波提取法，準(zhǔn)確稱取粉碎好的植物干粉10g，加入無(wú)水乙醇50mL于碘量瓶中，放入超聲波發(fā)生器中，超聲功率為400W，工作頻率為45KHz，超聲的溫度為25°C，超聲處理30min后，得到八角茴香的無(wú)水乙醇提取液，經(jīng)過(guò)抽濾(使用抽濾瓶和布氏漏斗，墊2 層濾紙)，然后將濾液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器內(nèi)減壓濃縮至稠膏狀(八角茴香無(wú)水乙醇提取物)。進(jìn)行殺蟲活性測(cè)定前，將膏狀物加水配制成濃度為20mg/mL的水溶液，然后裝入磨口棕色廣口瓶密封，置于4°C冰箱中保存?zhèn)溆茫礊橹参锾崛∫?八角茴香無(wú)水乙醇提取物)。方法二1)粉碎與方法一基本相同，不同的是粉碎后過(guò)35目篩，放入密封袋中備用。2)提取與方法一基本相同，不同的是植物干粉10g，加入無(wú)水乙醇45mL，超聲功率為300W，工作頻率為^KHz,超聲的溫度為23°C，超聲處理25min ；得到植物提取液(八角茴香無(wú)水乙醇提取物)。方法三1)粉碎與方法一基本相同，不同的是粉碎后過(guò)45目篩，放入密封袋中備用。2)提取與方法一基本相同，不同的是植物干粉10g，加入無(wú)水乙醇55mL，超聲功率為500W，工作頻率為ΙΟΟΚΗζ，超聲的溫度為^°C，超聲處理35min ；得到植物提取液(八角茴香無(wú)水乙醇提取物)。實(shí)施例2、毒殺活性測(cè)定方法采用觸殺法測(cè)定，具體步驟為取96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔分別加入配好的濃度為 20mg/mL的由實(shí)施例1步驟2的方法一獲得的植物提取液150 μ L，再加入等體積的由步驟1 得到的根結(jié)線蟲二齡幼蟲懸浮液，混勻，25°C靜置，分別于12h、24h和4 后在體視顯微鏡下觀察，檢查線蟲死活(針觸法)，僵直或卷曲不動(dòng)的蟲體視為死亡，按下式計(jì)算線蟲校正死亡率。以無(wú)菌水為對(duì)照，每處理重復(fù)3次，結(jié)果取平均值士標(biāo)準(zhǔn)誤。
死亡亨(。/ )_死亡線蟲數(shù)”· 夕匕亡車(/0卜供試線蟲數(shù)
^^^Φ οΛ處理組線蟲死亡率-對(duì)照組線蟲死亡率1ΛΛ
校正死IT率(％) =-, Utroijai^n 、女-X100
1 -對(duì)照組線蟲死IT率數(shù)據(jù)處理與分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)通過(guò)DPS2000分析整理，結(jié)果通過(guò)鄧肯氏新復(fù)極差多重比較法(Duncan's multiple range test,DMRT)進(jìn)行差異顯著性分析。殺線蟲強(qiáng)弱分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)按 Chandravadana 等(Chandravadana M V, Eugene S, Nidiry J, et al. Nematicidal activity of some plant extracts [J]. Indian J Nematol，1996，26 (2) :148-151.)的方法進(jìn)行，具體分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)為“_”表示無(wú)活性，校正死亡率< 10% ；“ + ”表示弱活性，校正死亡率為10% 30% ；“++”表示中等活性，校正死亡率為30% 50% ；“+++”表示較強(qiáng)活性， 校正死亡率為50% 80%;“++++”表示強(qiáng)活性，校正死亡率> 80%。同列數(shù)據(jù)后標(biāo)有不同小寫字母表示差異顯著(ρ < 0. 05，DMRT法)，大寫字母表示差異極顯著(ρ < 0. 01，DMRT 法)。以提取物濃度為lOmg/mL處理線蟲時(shí)，八角茴香無(wú)水乙醇提取物對(duì)根結(jié)線蟲的毒殺活性結(jié)果如下處理后1 后，八角茴香無(wú)水乙醇提取物對(duì)根結(jié)線蟲的毒殺活性強(qiáng)度為++++，校
5正死亡率為97. 7 士 2. 30aA,處理后24h后，八角茴香無(wú)水乙醇提取物對(duì)根結(jié)線蟲的毒殺活性強(qiáng)度為++++，校正死亡率為98. 85士 1. Ihak,處理后4 后，八角茴香無(wú)水乙醇提取物對(duì)根結(jié)線蟲的毒殺活性強(qiáng)度為++++，校正死亡率為100 士 0. OOaA。從以上結(jié)果可見(jiàn)，八角茴香的無(wú)水乙醇提取物對(duì)根結(jié)線蟲表現(xiàn)出強(qiáng)毒殺活性，處理24h后，線蟲校正死亡率分別為98. 85% ；處理4 后，線蟲校正死亡率分別為100%。根據(jù)DPS多重比較結(jié)果也表明，八角茴香的無(wú)水乙醇提取物在0. 05及0. 01的水平上差異不顯著，均表現(xiàn)出強(qiáng)毒殺活性。采用同樣方法檢測(cè)由實(shí)施例1步驟2的方法二和方法三獲得的植物提取液，結(jié)果
與方法一無(wú)顯著差異。
權(quán)利要求
1.一種制備八角茴香無(wú)水乙醇提取物的方法，包括如下步驟1)將八角茴香與無(wú)水乙醇混勻，得到混合物；2)將步驟1)得到的混合物進(jìn)行超聲處理，即得到八角茴香無(wú)水乙醇提取物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟1)中，所述八角茴香與所述無(wú)水乙醇的配比為IOg (45-55)ml ；步驟2)中，所述超聲的功率為300W-500W，所述超聲的工作頻率為28KHz-100KHz，所述超聲的時(shí)間為25min-35min ；所述超聲的溫度為23°C _28°C。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于步驟1)中，所述八角茴香與無(wú)水乙醇的配比為IOg (45、50或55)ml ；步驟2)中，所述超聲的功率為300W、400W或500W，所述超聲的工作頻率為28KHz、 45KHz或IOOKHz，所述超聲的時(shí)間為25min、30min或35min ；所述超聲的溫度為23°C、25°C 或 28°C。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于在步驟1)前，還包括將所述八角茴香粉碎至35目-45目大小的步驟；所述八角茴香粉碎至具體為35目、40目或45目大??；在步驟2)后，還包括如下步驟將所述超聲處理得到的超聲產(chǎn)物依次經(jīng)抽濾、濾液濃縮至膏狀，得到八角茴香無(wú)水乙醇提取物。
5.由權(quán)利要求1-4中任一所述的方法制備的八角茴香無(wú)水乙醇提取物。
6.權(quán)利要求5所述的八角茴香無(wú)水乙醇提取物在殺線蟲和/或防線蟲中的應(yīng)用。
7.權(quán)利要求5所述的八角茴香無(wú)水乙醇提取物在制備線蟲的生防制劑中的應(yīng)用。
8.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的應(yīng)用，其特征在于所述線蟲為根結(jié)線蟲(Meloidogyne spp. ) O
9.一種線蟲的生防制劑，其活性成分為權(quán)利要求5所述的八角茴香無(wú)水乙醇提取物。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的生防制劑，其特征在于所述線蟲為根結(jié)線蟲(Meloidogyne spp. ) O
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種八角茴香殺線蟲提取物及其制備方法。本發(fā)明提供了一種制備八角茴香無(wú)水乙醇提取物的方法，包括如下步驟1)將八角茴香與無(wú)水乙醇混勻，得到混合物；2)將步驟1)得到的混合物進(jìn)行超聲處理，并經(jīng)過(guò)抽濾和濃縮，即得到八角茴香無(wú)水乙醇提取物。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，采用無(wú)水乙醇對(duì)八角茴香進(jìn)行提取，并將提取液對(duì)根結(jié)線蟲的毒殺效果測(cè)試，結(jié)果為該提取物對(duì)根結(jié)線蟲有強(qiáng)的毒殺活性；說(shuō)明本發(fā)明的提取物為今后根結(jié)線蟲生防制劑的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。本發(fā)明利用天然無(wú)害的植物材料提取殺線蟲活性物質(zhì)，可減少化學(xué)農(nóng)藥帶來(lái)的無(wú)污染，且提取方法簡(jiǎn)單，在植物根結(jié)線蟲病防治上易于推廣應(yīng)用。
文檔編號(hào)A61P5/00GK102283256SQ20111021403
公開(kāi)日2011年12月21日 申請(qǐng)日期2011年7月28日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月28日
發(fā)明者劉正坪, 宋慶豐, 張夏蘭, 耿文龍, 蔡建波, 趙曉燕, 馬喆, 魏艷敏 申請(qǐng)人:北京農(nóng)學(xué)院