專利名稱：：肝素復(fù)合物及其制備方法與應(yīng)用的制作方法肝素復(fù)合物及其制備方法與應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種肝素復(fù)合物及其制備方法與應(yīng)用，尤其涉及一種共價接枝肝素復(fù)合物及其制備方法與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：肝素(h印arin)是一種陰離子粘多糖，具有抗凝血抗血栓活性Kwon0H，NhoYCetal.Biocompatiblesurfacesbyimmobilizationofheparinondi咖ond-likecarbonfilmsdepositedonvarioussubstrates.Surf.InterfaceAnal.2000，29:386L低分子肝素(L麗H)是由肝素經(jīng)降解得到低分子量的肝素片段或經(jīng)分級法得到的低分子量肝素組分，相對分子質(zhì)量范圍一般在30008000，臨床上主要用于預(yù)防和治療血栓栓塞性疾病。肝素共價接枝到材料上形成的復(fù)合物具有諸多優(yōu)點，如可以達(dá)到肝素固定化的目的，有效防止肝素在用藥部位被血流帶走。同時，復(fù)合物具有生物相容性和抗凝血性。近年來已有大量的共價接枝肝素的復(fù)合物合成出來，如聚氨基甲酸酯-PEO-肝素，這些材料顯示了較好的物化特性。有報道肝素隨著大分子表面的聚乙烯氧化物(PE0)親水間隔臂的長度的增加，其抗凝活性而增加。但目前制備的肝素復(fù)合物安全性、穩(wěn)定性和對蛋白藥物的載藥能力仍不夠理想。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是針對現(xiàn)有肝素復(fù)合物的不足之處，提供一種肝素復(fù)合物，其作為藥物載體或藥用輔料具備更好穩(wěn)定性、安全性和載藥能力。本發(fā)明要解決的另一個技術(shù)問題是要提供一種具備更好穩(wěn)定性、耐壓性和載藥能力的肝素復(fù)合物的制備方法。本發(fā)明另一個目的是開發(fā)肝素與泊洛沙姆合成的新復(fù)合物在醫(yī)藥和生物學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用了以下的技術(shù)方案—種肝素與泊洛沙姆形成的復(fù)合物具有以下通式Y(jié)-X-Y或Y-g-X-g-Y或X-Y或X-g-Y其中X為泊洛沙姆，g為間臂分子，Y為肝素，X、g、Y或者X、Y通過共價鍵結(jié)合。上述的泊洛沙姆為聚氧乙烯聚氧丙烯醚，S卩a-氫-"羥聚(氧乙烯)a-聚(氧丙烯)b-聚(氧乙烯)c嵌段共聚物，結(jié)構(gòu)式為H0(CH2CH20)a(0CHCH3CH2)b(CH2CH20)c，在共聚物中，a和c為2150，b為1567。上述的肝素包括重組肝素、天然肝素、衍生肝素、肝素鹽、低分子量肝素及其鹽、能與泊洛沙姆及其衍生物的官能團(tuán)反應(yīng)的化學(xué)改性肝素和類肝素分子及其鹽類。上述的低分子肝素包括但不局限于低分子肝素鈉、低分子肝素鈣、依諾肝素，替地肝素。上述的間臂分子g是指任何用來連接肝素和泊洛沙姆的大分子或小分子結(jié)構(gòu)，其中大分子為合成高聚物或生物高聚物，包括聚己內(nèi)酯、聚乙二醇、多糖、蛋白質(zhì)，小分子是指含有氨基和/或羧基官能團(tuán)，能夠與肝素分子內(nèi)的羧基或氨基反應(yīng)的小分子，包括乙二胺?！N肝素復(fù)合物的制備方法，利用泊洛沙姆的末端羥基和肝素分子內(nèi)的羧基或氨基的活性基團(tuán)反應(yīng)得到所述肝素復(fù)合物，該反應(yīng)過程為泊洛沙姆或連有間臂分子的泊洛沙姆羥基末端羧酸化，而后與肝素的氨基反應(yīng)；或者泊洛沙姆或連有間臂分子的泊洛沙姆羥基末端氨基化，而后與肝素的羧基反應(yīng)?！N肝素復(fù)合物的應(yīng)用，該肝素復(fù)合物作為藥用輔料或遞送載體應(yīng)用。上述的該復(fù)合物作為藥用輔料是指上述的該復(fù)合物用來制備水溶液分散體，包括乳劑、脂質(zhì)體、膠束、微粒；或作為長循環(huán)、溫度或ra敏感性的藥物載體材料應(yīng)用。上述的該復(fù)合物作為遞送載體應(yīng)用是指上述的該復(fù)合物可以作為與肝素相親的化學(xué)物質(zhì)、酶或大分子蛋白，包括成纖維細(xì)胞生長因子的遞送載體。上述的該復(fù)合物形成的制劑或材料應(yīng)用于口服、注射、經(jīng)皮、粘膜給藥系統(tǒng)中或外科、植入手術(shù)中。具體實施方式泊洛沙姆(poloxamer)，商品名為pluronic，是白色或微黃色半透明蠟狀固體，用作表面活性劑、乳化劑、栓劑基質(zhì)、賦形劑等。泊洛沙姆因有防止溶血作用，可以用于靜脈注射，對某些藥物可以起到助溶作用。利用泊洛沙姆和肝素直接或間接地共價結(jié)合，并作為載體材料制成相應(yīng)的制劑，可以達(dá)到抗凝血、抗血栓和緩釋藥物的目的。本發(fā)明的肝素與泊洛沙姆形成的復(fù)合物具有以下通式Y(jié)-X-Y或Y-g-X-g-Y或X-Y或X-g-Y其中X為泊洛沙姆，g為間臂分子，Y為肝素，X、g、Y或者X、Y通過共價鍵結(jié)合。上述的泊洛沙姆為聚氧乙烯聚氧丙烯醚，S卩a-氫-"羥聚(氧乙烯)a-聚(氧丙烯)b-聚(氧乙烯)c嵌段共聚物，結(jié)構(gòu)式為HO(CH2CH20)a(0CHCH3CH2)b(CH2CH20)c，在共聚物中，a和c為2150，b為1567。上述的肝素包括重組肝素、天然肝素、衍生肝素、肝素鹽、低分子量肝素及其鹽、能與泊洛沙姆及其衍生物的官能團(tuán)反應(yīng)的化學(xué)改性肝素和類肝素分子及其鹽類。上述的低分子肝素包括但不局限于低分子肝素鈉、低分子肝素鈣、依諾肝素，替地肝素。上述的間臂分子g是指任何用來連接肝素和泊洛沙姆的大分子或小分子結(jié)構(gòu)，其中大分子為合成高聚物或生物高聚物，包括聚己內(nèi)酯、聚乙二醇、多糖、蛋白質(zhì)，小分子是指含有氨基和/或羧基官能團(tuán)，能夠與肝素分子內(nèi)的羧基或氨基反應(yīng)的小分子，包括乙二胺。肝素接枝到泊洛沙姆形成復(fù)合物的制備方法是利用了泊洛沙姆的末端羥基和肝素分子內(nèi)的羧基或氨基的活性基團(tuán)?？梢允遣绰迳衬坊蜻B有間臂分子的泊洛沙姆羥基末端羧酸化，而后與肝素的氨基反應(yīng)；也可以是泊洛沙姆或連有間臂分子的泊洛沙姆羥基末端氨基化，而后與肝素的羧基反應(yīng)。具體反應(yīng)過程如下a.泊洛沙姆或連有間臂分子的泊洛沙姆羥基末端羧酸化，而后與肝素的氨基反應(yīng)—定量的泊洛沙姆或連有間臂分子的泊洛沙姆、丁二酐、4-二甲基氨基吡啶、三乙胺，置于二氧六環(huán)中，攪拌反應(yīng)過夜，所得反應(yīng)物的末端為羧基。利用EDC/NHS方法，加入一定量的肝素，攪拌反應(yīng)24h，然后透析3天，透析袋內(nèi)溶液經(jīng)過冷凍干燥得到肝素與泊洛沙姆形成的復(fù)合物凍干固體。b.泊洛沙姆或連有間臂分子的泊洛沙姆羥基末端氨基化，而后與肝素的羧基反應(yīng)—定量的泊洛沙姆或連有間臂分子的泊洛沙姆在三乙胺催化下與乙二胺反應(yīng)，得末端為氨基的產(chǎn)物，然后利用1-乙基-3，3-二甲基氨丙基碳化二亞胺(EDC)/N-羥基于二酰亞胺(NHS)方法與肝素的羧基進(jìn)行反應(yīng)，可得肝素與泊洛沙姆形成的復(fù)合物。上述的該復(fù)合物作為藥用輔料或遞送載體應(yīng)用，亦在以抗凝血、抗血栓為目的醫(yī)學(xué)和生物學(xué)中應(yīng)用。作為藥用輔料時，上述的該復(fù)合物用來制備水溶液分散體，包括乳劑、脂質(zhì)體、膠束、微粒；或作為長循環(huán)、溫度或ra敏感性的藥物載體材料應(yīng)用。上述的復(fù)合物結(jié)合與肝素相親的化學(xué)物質(zhì)、酶或大分子蛋白，包括成纖維細(xì)胞生長因子，達(dá)到分離這些化學(xué)物質(zhì)或蛋白的目的，亦可以作為運(yùn)送載體與這些化學(xué)物質(zhì)或蛋白制成緩釋制劑，達(dá)到緩慢釋放的目的。上述的該復(fù)合物作為涂層劑應(yīng)用于人造器官或醫(yī)療器械的表面改性。上述的該復(fù)合物形成的制劑或材料應(yīng)用于口服、注射、經(jīng)皮、粘膜給藥系統(tǒng)或外科、植入手術(shù)中。以下從幾個具體實施例進(jìn)一步說明本發(fā)明。實施例一、低分子肝素_泊洛沙姆的合成與其體外抗凝血實驗1-1.低分子肝素_泊洛沙姆_低分子肝素的合成稱取泊洛沙姆407(相對分子量M=12000，其中a=c=101，b=56)12g，于一圓底燒瓶中，加入2mmo1的丁二酐、2mmo1的4-二甲基氨基吡啶及0.55ml三乙胺，并溶解于200ml二氧六環(huán)中，攪拌反應(yīng)24h得末端為羧基的泊洛沙姆，以其為反應(yīng)物，利用1-乙基-3，3-二甲基氨丙基碳化二亞胺(EDC)/N-羥基于二酰亞胺(NHS)方法，加入10g的低分子肝素鈉，攪拌反應(yīng)24h。反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)透析袋透析3天，所得產(chǎn)物通過冷凍干燥得到固體粉末，即為低分子肝素_泊洛沙姆_低分子肝素。1-2.低分子肝素_泊洛沙姆_低分子肝素的體外抗凝血實驗運(yùn)用下面的玻片法，測定不同濃度低分子肝素_泊洛沙姆_低分子肝素溶液的體外抗凝血時間，同法操作以0.lg/ml低分子肝素、生理鹽水分別為陽性對照和空白對照。含有0.66g/ml、0.44g/ml、0.22g/ml的低分子肝素_泊洛沙姆_低分子肝素溶液分別為高、中、低三個濃度分組。玻片法分別用含有高、中、低濃度的低分子肝素_泊洛沙姆_低分子肝素溶液以及低分子肝素和生理鹽水浸泡干凈的載玻片，取出晾干。用毛細(xì)玻管將Wistar大鼠做眼眶內(nèi)眥取血，迅速滴血于載玻片上，血滴直徑約510mm，立即開始記時，此后每隔30s用干燥潔凈針頭挑動血液1次至針頭能挑起纖維蛋白絲為止，即為凝血時間。實驗結(jié)果如下5<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>對照空白組和陽性組結(jié)果，表明低分子肝素_泊洛沙姆_低分子肝素復(fù)合物保留了肝素的抗凝血效果。實施例二、低分子肝素_泊洛沙姆復(fù)合物膠束的制備取上述制備的低分子肝素_泊洛沙姆_低分子肝素50mg，分散于20ml蒸餾水中，在37t:下超聲處理2min，形成膠束混懸液，然后冷凍干燥，制成固體凍干品，通過實施例一的體外抗凝血實驗觀察，低分子肝素-泊洛沙姆復(fù)合物膠束具有抗凝血作用，可以單用或作為藥用輔料應(yīng)用于溶栓制劑中。實施例三依諾肝素-聚己內(nèi)酯-泊洛沙姆的合成與酸性成纖維細(xì)胞生長因子(aFGF)緩釋脂質(zhì)體的制備3-1.依諾肝素_聚己內(nèi)酯_泊洛沙姆_聚己內(nèi)酯_依諾肝素的合成泊洛沙姆188(M=8350，a=c=80，b=27)2,1與3ml己內(nèi)酯在Sn-Oct為催化劑、Ar氣保護(hù)下真空狀態(tài)進(jìn)行聚合，攪拌24h后停止反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物以10ml氯仿溶解，加入10倍量體積的乙醚沉淀，過濾，重復(fù)兩次以純化所得產(chǎn)物。將產(chǎn)物在4mmo1丁二酐(SA)、2mmo14-二甲基氨基吡啶(DMAP)、0.55ml三乙胺(TEA)，30ml二氧六環(huán)為溶劑下攪拌反應(yīng)24小時，以10ml氯仿溶解，加入10倍量體積的乙醚沉淀，過濾，重復(fù)兩次以純化所得產(chǎn)物。利用1-乙基-3，3-二甲基氨丙基碳化二亞胺(EDC)/N-羥基于二酰亞胺(NHS)方法，所得產(chǎn)物與依諾肝素反應(yīng)，攪拌反應(yīng)24h，反應(yīng)最終產(chǎn)物經(jīng)透析袋透析3天，最后透析袋內(nèi)溶液通過冷凍干燥得到固體粉末，即依諾肝素_聚己內(nèi)酯_泊洛沙姆_聚己內(nèi)酯_依諾肝素。3-2.載aFGF緩釋脂質(zhì)體的制備取一定量上述制備的依諾肝素_聚己內(nèi)酯_泊洛沙姆_聚己內(nèi)酯_依諾肝素，卵磷脂、膽固醇按2:10:l溶解在氯仿中，攪勻，真空干燥，將所得粉末與10ml左右80IU/ml的aFGF水溶液混合，加入1.2mg聚山梨酯80，50rmin-l攪拌2h，制成載有aFGF的脂質(zhì)體。載有aFGF的脂質(zhì)體通過公式包封率WX二(Ct-CL)/CtX100%計算，包封率平均值達(dá)65%，體外釋放實驗表明載有aFGF的脂質(zhì)體，沒有突釋現(xiàn)象，12小時內(nèi)的釋放量要求達(dá)到90%，具有較好的緩釋效果。實施例四、替地肝素_乙二胺_泊洛沙姆的合成及其作為藥用輔料的應(yīng)用1、替地肝素-乙二胺-泊洛沙姆的合成泊洛沙姆338(M=15000，a=c=141，b=44)15g，在100ml二氯甲烷為溶劑，0.6ml三乙胺做催化劑作用下與2mmo1的Cl6'-0^j^N02室溫下反應(yīng)4h，然后，加入2.5mmo1乙二胺，繼續(xù)反應(yīng)12h，反應(yīng)的產(chǎn)物為末端氨基，利用1-乙基_3，3-二甲基氨丙基碳化二亞胺(EDC)/N-羥基于二酰亞胺(NHS)方法，將其與10g依諾肝素的羧基反應(yīng)，攪拌反應(yīng)24h，反應(yīng)最終產(chǎn)物經(jīng)透析袋透析3天，冷凍干燥，即得形成新材料為替地肝素_乙二胺-泊洛沙姆。2、含替地肝素-乙二胺-泊洛沙姆的維生素E乳膏的制備2.1處方維生素E20g、十八醇6g、單甘酯6g、液體石蠟3g、甘油4g、十二烷基硫酸鈉0.7g、尿囊素0.5g、低分子肝素-泊洛沙姆(57IU/mg)10g、氮酮1.Og、尼鉑金乙脂0.05g，蒸餾水50ml，制備乳膏總量100g2.2制備方法取處方量的十八醇、單甘酯、液體石蠟、尼鉑金乙脂加熱至7(TC融化后為油相備用；取甘油、十二烷基硫酸鈉、尿囊素加入到蒸餾水中，加熱至7(TC溶解后為水相，過濾，將油相加入到水相中，混合攪拌，待溫度降至55t:以下時，加入低分子肝素-泊洛沙姆、氮酮、維生素E，繼續(xù)攪拌至均勻，得到含低分子肝素-泊洛沙姆的維生素E乳膏。此制劑中，低分子肝素_泊洛沙姆作為新型藥用輔料，既具有表面活性劑的作用，又起到固定緩釋肝素的作用。在上述實施例中，僅對本發(fā)明進(jìn)行了示范性描述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員在閱讀本專利申請后可以在不脫離本發(fā)明的精神和范圍的情況下對本發(fā)明進(jìn)行各種修改。權(quán)利要求一種肝素復(fù)合物，其特征在于具有以下通式Y(jié)-X-Y或Y-g-X-g-Y或X-Y或X-g-Y；其中X為泊洛沙姆，g為間臂分子，Y為肝素，X、g、Y或者X、Y通過共價鍵結(jié)合。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的肝素復(fù)合物，其特征在于所述的泊洛沙姆為聚氧乙烯聚氧丙烯醚，g卩a-氫-"羥聚(氧乙烯)a-聚(氧丙烯)b-聚(氧乙烯)c嵌段共聚物，結(jié)構(gòu)式為H0(CH2CH20)a(0CHCH3CH2)b(CH2CH20)c，在共聚物中，a和c為2150，b為1567。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的肝素復(fù)合物，其特征在于所述的肝素包括重組肝素、天然肝素、衍生肝素、肝素鹽、低分子量肝素及其鹽、能與泊洛沙姆及其衍生物的官能團(tuán)反應(yīng)的化學(xué)改性肝素和類肝素分子及其鹽類。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的肝素復(fù)合物，其特征在于所述的低分子肝素包括低分子肝素鈉、低分子肝素鈣、依諾肝素，替地肝素。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的肝素復(fù)合物，其特征在于所述的間臂分子g是指任何用來連接肝素和泊洛沙姆的大分子或小分子結(jié)構(gòu)，其中大分子為合成高聚物或生物高聚物，包括聚己內(nèi)酯、聚乙二醇、多糖、蛋白質(zhì)，小分子是指含有氨基和/或羧基官能團(tuán)，能夠與肝素分子內(nèi)的羧基或氨基反應(yīng)的小分子，包括乙二胺。6.根據(jù)權(quán)利要求1至5任一項所述的肝素復(fù)合物的制備方法，其特征在于利用泊洛沙姆的末端羥基和肝素分子內(nèi)的羧基或氨基的活性基團(tuán)反應(yīng)得到所述肝素復(fù)合物，該反應(yīng)過程為泊洛沙姆或連有間臂分子的泊洛沙姆羥基末端羧酸化，而后與肝素的氨基反應(yīng)；或者泊洛沙姆或連有間臂分子的泊洛沙姆羥基末端氨基化，而后與肝素的羧基反應(yīng)。7.根據(jù)權(quán)利要求1至5任一項所述的肝素復(fù)合物的應(yīng)用，其特征在于該肝素復(fù)合物作為藥用輔料或遞送載體應(yīng)用。8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的肝素復(fù)合物的應(yīng)用，其特征在于該肝素復(fù)合物作為藥用輔料的應(yīng)用包括該復(fù)合物用來制備水溶液分散體，包括乳劑、脂質(zhì)體、膠束、微粒；或作為長循環(huán)、溫度或ra敏感性的藥物載體材料應(yīng)用。9.如權(quán)利要求7所述的肝素復(fù)合物的應(yīng)用，其特征在于該肝素復(fù)合物可以作為與肝素相親的化學(xué)物質(zhì)、酶或大分子蛋白的遞送載體。10.根據(jù)權(quán)利要求89所述的肝素復(fù)合物的應(yīng)用，其特征在于該肝素復(fù)合物形成的制劑或材料應(yīng)用于口服、注射、經(jīng)皮、粘膜給藥系統(tǒng)中或外科、植入手術(shù)中。全文摘要本發(fā)明涉及一種肝素復(fù)合物，該肝素復(fù)合物具有以下通式Y(jié)-X-Y或Y-g-X-g-Y或X-Y或X-g-Y，其中X為泊洛沙姆，g為間臂分子，Y為肝素，X、g、Y或者X、Y通過共價鍵結(jié)合。本發(fā)明還提供該肝素復(fù)合物的制備方法。該肝素復(fù)合物可作為藥用輔料或運(yùn)送載體應(yīng)用。文檔編號A61K9/107GK101766819SQ20091010493公開日2010年7月7日申請日期2008年12月31日優(yōu)先權(quán)日2008年12月31日發(fā)明者周志彩,唐琴琴,張翼,徐艷艷,李校堃,田吉來,趙應(yīng)征,靳卓,高慧升,魯翠濤申請人:溫州醫(yī)學(xué)院