專利名稱：腸道病毒71型感染7日齡c57/bl6小鼠模型的建立方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種腸道病毒71型感染7日齡C57/BL6小鼠模型的建立方法。
背景技術(shù)：
腸道病毒71型(EV71)屬于小RNA病毒科腸道病毒屬，是手足口病(HFMD)的主要病原(Hand Foot and Mouth Disease, HFMD)。自2008年以來我國多次發(fā)生EV71的暴發(fā)感染，時(shí)有病死發(fā)生，已經(jīng)成為備受關(guān)注的公共衛(wèi)生問題。目前其感染和致病機(jī)制、病毒結(jié)構(gòu)特征及毒力相關(guān)基因等還不明確，并且臨床缺乏有效的藥物和疫苗。因此深刻理解病毒生物學(xué)特性與宿主感染的相互關(guān)系，疫苗設(shè)計(jì)研發(fā)及藥物篩選研究意義重大。由于EV71病毒具有嚴(yán)格的宿主特異性，目前國內(nèi)尚未建立穩(wěn)定的動(dòng)物感染模型。 這一現(xiàn)狀從根本上制約了 EV71臨床基礎(chǔ)研究和臨床防治策略的制定，導(dǎo)致臨床高效特異的治療藥物和預(yù)防性疫苗的缺乏。因此，建立穩(wěn)定的動(dòng)物感染模型成為EV71研究和防治的關(guān)鍵問題。

發(fā)明內(nèi)容
針對上述現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明提供了一種腸道病毒71型感染7日齡C57/BL6小鼠模型的建立方法，動(dòng)物模型的建立可促進(jìn)對腸道病毒71型致病機(jī)制和宿主免疫機(jī)制的研究， 并可用于高效抗病毒藥物的篩選和疫苗評價(jià)，為EV71病原學(xué)研究、臨床治療研究以及疫苗學(xué)研究解決了關(guān)鍵性難題。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的一種腸道病毒71型感染7日齡C57/BL6小鼠模型的建立方法，包括以下步驟取 7日齡C57/BL6小鼠，后肢肌肉注射病毒液，即得腸道病毒71型感染的小鼠模型。所述病毒液注射量為20 μ L，是通過以下方法制得的將EV71毒種，以 200 μ L/100mL細(xì)胞培養(yǎng)瓶的接種量接種MA104細(xì)胞，37°C,5% CO2培養(yǎng)，每天觀察細(xì)胞病變情況，至MA104細(xì)胞70%出現(xiàn)凝集、皺縮時(shí)，將整瓶細(xì)胞凍融，離心取上清，即得到EV71的病毒液。所述EV71毒種，為現(xiàn)有技術(shù)中已有的，常規(guī)取得即可，本發(fā)明對此無限制，不再贅述。所述建立方法，還包括以下小鼠模型的鑒定步驟飼養(yǎng)上述接種腸道病毒71型的小鼠，5天后，后肢出現(xiàn)反應(yīng)遲緩、后肢癱瘓，7天后死亡的，即為感染成功的小鼠模型。本發(fā)明成功地建立了穩(wěn)定的腸道病毒71型感染的小鼠模型，其后肢癱瘓率一般為70% 100%，死亡率為30 100%。本發(fā)明為科研人員研究腸道病毒71型病原學(xué)、腸道病毒71型致病機(jī)制以及高效抗病毒藥物的篩選和疫苗的研制提供了基礎(chǔ)，具有廣闊的應(yīng)用前景。


圖1為臨床分離毒株的RT-PCR鑒定的電泳圖，其中，M = Maker (D2000)，N=陰性細(xì)胞對照，B =空白試劑對照，1 =分離毒株。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。實(shí)施例1建立感染腸道病毒71型的7日齡C57/BL6小鼠模型步驟如下1、EV71的分離鑒定本發(fā)明所采用的EV71毒株是從臨床的重癥手足口病人的糞便標(biāo)本中分離的，同時(shí)采用人橫紋肌肉瘤細(xì)胞株(RD)、恒河猴腎細(xì)胞株(MA104)和非洲綠猴腎細(xì)胞株(Vero)三種細(xì)胞對標(biāo)本中的病毒進(jìn)行分離，結(jié)果三種細(xì)胞上菌出現(xiàn)了細(xì)胞病變，傳代后凍存毒種。然后提取分離到的EV71的基因組RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，采用EV71國家標(biāo)準(zhǔn)引物對分離毒株進(jìn)行鑒定，結(jié)果表明分離毒株在226bp處出現(xiàn)了很亮的條帶(如圖1所示)，可證實(shí)從臨床手足口重癥病人糞便標(biāo)本中分離的毒株為EV71。2、EV71感染動(dòng)物模型的建立2.1小鼠的準(zhǔn)備購買SPF級別的C57/BL6乳鼠2組(帶母鼠)，每組6只，25°C、濕度50%，分格飼養(yǎng)在ABSL-2實(shí)驗(yàn)室的凈化動(dòng)物飼養(yǎng)柜內(nèi)，每天觀察動(dòng)物生長情況，C57/BL6乳鼠生長狀態(tài)良好。2. 2毒種的準(zhǔn)備將分離的EV71毒種，以200yL/100mL細(xì)胞培養(yǎng)瓶的接種量接種MA104細(xì)胞， 37°C、5% CO2培養(yǎng)，每天觀察細(xì)胞病變情況。接種EV71后第2天，MA104細(xì)胞約70%出現(xiàn)了凝集、皺縮，將整瓶細(xì)胞凍融后，離心取上清，即得到EV71的病毒液。2. 3EV71感染動(dòng)物模型的建立2. 3. 1動(dòng)物分組將兩組動(dòng)物分別設(shè)為病毒組和正常對照組，病毒組肌注接種EV71病毒，正常對照組左后肢肌注接種含2%胎牛血清的1640培養(yǎng)液。2. 3. 2 接種 EV71采用無菌的微量進(jìn)樣器，病毒組每只C57/BL6小鼠左后肢肌肉注射病毒液20 μ L， 正常對照組每只C57/BL6小鼠左后肢肌肉注射含2%胎牛血清的1640培養(yǎng)液20 μ L。然后將動(dòng)物按相同的條件飼養(yǎng)在凈化動(dòng)物飼養(yǎng)柜內(nèi)，每天觀察動(dòng)物。2. 3. 3接毒后的觀察接種0天至4天病毒組和正常對照組均無異常；接種5天后病毒組動(dòng)物后肢全部出現(xiàn)明顯后肢癱瘓，正常對照組無異常，取兩組動(dòng)物各3只分別進(jìn)行解剖固定；至接種7天病毒組剩余乳鼠均死亡，正常對照組無異常，動(dòng)物模型建立成功。
權(quán)利要求
1.一種腸道病毒71型感染7日齡C57/BL6小鼠模型的建立方法，其特征在于，包括以下步驟取7日齡C57/BL6小鼠，后肢肌肉注射病毒液，即得腸道病毒71型感染的小鼠模型。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的腸道病毒71型感染7日齡C57/BL6小鼠模型的建立方法，其特征在于所述病毒液注射量為20 μ L，是通過以下方法制得的將EV71毒種，以 200 μ L/100mL細(xì)胞培養(yǎng)瓶的接種量接種MA104細(xì)胞，37°C,5% CO2培養(yǎng)，每天觀察細(xì)胞病變情況，至MA104細(xì)胞70%出現(xiàn)凝集、皺縮時(shí)，將整瓶細(xì)胞凍融，離心取上清，即得到EV71的病毒液。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的腸道病毒71型感染7日齡C57/BL6小鼠模型的建立方法，其特征在于還包括以下小鼠模型的鑒定步驟飼養(yǎng)上述接種腸道病毒71型的乳鼠，5天后， 后肢出現(xiàn)反應(yīng)遲緩、后肢癱瘓，7天后死亡的，即為感染成功的乳鼠模型。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種腸道病毒71型感染7日齡C57/BL6小鼠模型的建立方法取7日齡C57/BL6小鼠，后肢肌肉注射病毒液，即得腸道病毒71型感染的小鼠模型。所述病毒液注射量為20μL，是通過以下方法制得的將EV71毒種，以200μL/100mL細(xì)胞培養(yǎng)瓶的接種量接種MA104細(xì)胞，37℃、5％CO2培養(yǎng)，每天觀察細(xì)胞病變情況，至MA104細(xì)胞有70％出現(xiàn)凝集、皺縮時(shí)，將整瓶細(xì)胞凍融，離心取上清，即得到EV71的病毒液。本發(fā)明成功地建立了穩(wěn)定的腸道病毒71型感染7日齡C57/BL6小鼠模型，為腸道病毒71型生物學(xué)特性研究、致病機(jī)制及宿主免疫應(yīng)答機(jī)制研究以及高效抗病毒藥物的篩選和疫苗的研制提供了基礎(chǔ)，具有廣闊的應(yīng)用前景。
文檔編號A61K35/76GK102441011SQ20111032799
公開日2012年5月9日 申請日期2011年10月25日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月25日
發(fā)明者姜國勝, 孟紅, 宋楠楠, 岳盈盈, 李志會, 李鵬 申請人:山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所