專利名稱：魚腥草有效部位及其提取方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于中藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種植物魚腥草的有效部位提取物、提取方法和其在制備抗腫瘤藥物方面的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
魚腥草(Houttuynia cordata Thunb)為三白草科蕺菜屬植物,原名“蕺”,始載于《名醫(yī)別錄》，列為下品。分布于長江流域以南地區(qū)，主產(chǎn)于浙江、江蘇、安徽、福建、河南等省。藥用其帶根全草，性辛，味微寒，入肺經(jīng)。具有清熱解毒、消癰排膿、利尿通淋等功能，用于肺癰吐膿、痰熱喘咳、熱淋、熱痢、癰腫瘡毒、咽喉乳蛾、痔瘡脫肛等癥，被譽(yù)為“中藥中的廣譜抗生素”?！侗静菥V目》記載“其葉腥氣，故俗稱魚腥草?！濒~腥草為藥食兩用的植物。惡性腫瘤的發(fā)生率逐年增高，已經(jīng)成為威脅人類健康的一大殺手。由于中藥的多靶點(diǎn)和副作用小等優(yōu)點(diǎn)，從傳統(tǒng)藥物中尋找抗腫瘤活性物質(zhì)已成為目前的研究方向和熱點(diǎn)。現(xiàn)代藥理學(xué)研究證明，魚腥草具有解熱、抗炎、抗菌、抗病毒、增強(qiáng)機(jī)體免疫功能、抗過敏、鎮(zhèn)咳、抗抑郁、改善胰島素抵抗、降糖、改善心室重構(gòu)等作用。目前尚未有魚腥草揮發(fā)油、乙酸乙酯部位或乙醇部位具有抗腫瘤作用的相關(guān)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供一種魚腥草有效部位及其提取方法，該魚腥草有效部位具有抗腫瘤作用，可以用來制備抗腫瘤藥物。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取如下技術(shù)方案
一種魚腥草有效部位，其選自魚`腥草揮發(fā)油、魚腥草乙酸乙酯部位和魚腥草乙醇部位中的一種或兩種以上的混合物。所述魚腥草有效部位的提取方法，其包括下述步驟將用水浸泡過的魚腥草進(jìn)行水蒸氣蒸餾，收集蒸餾液，蒸餾液靜置冷卻分層后，取上層的油層即得魚腥草揮發(fā)油；將用水提取過的魚腥草渣晾干或烘干后依次用石油醚、乙酸乙酯和乙醇回流提取，提取液揮干溶劑后即分別得到魚腥草乙酸乙酯部位和魚腥草乙醇部位。具體的,可將干燥的魚腥草粉碎,用其重量8 — 15倍的水浸泡8 — 15h (用以使魚腥草充分浸潤)，然后將魚腥草及浸泡液進(jìn)行水蒸氣蒸餾，蒸餾時(shí)間6 -1Oh0將用水提取過的魚腥草渣晾干或烘干后依次用15 - 20倍(ml/g)的石油醚、乙酸乙酯和95%乙醇回流提取I 一 4h。所述魚腥草有效部位在制備抗腫瘤藥物方面的應(yīng)用。魚腥草揮發(fā)油可按本領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)直接或者包合后制成多種劑型，如溶液劑(如芳香水劑、醑劑、乳劑等)、注射劑、膠囊劑、片劑、顆粒劑、滴丸、緩釋制劑及納米制劑等。也可以魚腥草揮發(fā)油為活性物質(zhì)，與醫(yī)學(xué)上可接受的藥用輔料、賦形劑等混配、組合，制成上述各種劑型?；蛘哌€可以與魚腥草乙酸乙酯部位和/或乙醇部位或其他抗腫瘤藥物共同作為活性物質(zhì)，與醫(yī)學(xué)上可接受的藥用輔料、賦形劑等混配、組合，制成上述各種劑型。本發(fā)明魚腥草有效部位的提取方法簡單，經(jīng)體外細(xì)胞試驗(yàn)證明所得魚腥草揮發(fā)油、魚腥草こ酸こ酯部位和こ醇部位具有較強(qiáng)的抗腫瘤活性，可用于制備抗腫瘤藥物。
具體實(shí)施例方式以下通過具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)ー步說明，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不局限于此。實(shí)施例1
一種魚腥草有效部位，其選自魚腥草揮發(fā)油、魚腥草こ酸こ酯部位和魚腥草こ醇部位中的ー種或兩種以上的混合物。所述魚腥草有效部位的提取方法包括下述步驟取500g粉碎過的魚腥草全草置于燒瓶中(燒瓶中可放入數(shù)粒沸石)，加5000ml水振搖混合后浸泡12h左右，然后將魚腥草及浸泡液進(jìn)行水蒸氣蒸餾(保持微沸6h)，收集蒸餾液。蒸餾液靜置冷卻分層后，取上層的淡黃色油層(約0. 5ml)即得魚腥草揮發(fā)油；將用水提取過的魚腥草渣晾干后依次用7500ml石油醚、7500mlこ酸こ酯和7500ml 95%こ醇回流提取3h (即石油醚回流提取結(jié)束后，將分離出來的固體魚腥草渣添加こ酸こ酯進(jìn)行回流提取，提取結(jié)束后固液分離，液相的即為こ酸こ酯提取液)，所得提取液揮干溶剤，分別得到5. 6g棕黑色浸膏(即こ酸こ酯部位)、13. 5g棕褐色浸膏(即こ醇部位)。實(shí)施例2
一種魚腥草有效部位，其選自魚腥草揮發(fā)油、魚腥草こ酸こ酯部位和魚腥草こ醇部位中的ー種或兩種以上的混合物。所述魚腥草有效 部位的提取方法包括下述步驟取500g粉碎過的魚腥草全草置于燒瓶中(燒瓶中可放入數(shù)粒沸石)，加6000ml水振搖混合后浸泡15h左右，然后將魚腥草及浸泡液進(jìn)行水蒸氣蒸餾(保持微沸8h)，收集蒸餾液。蒸餾液靜置冷卻分層后，取上層的淡黃色油層(約0. 6ml)即得魚腥草揮發(fā)油；將用水提取過的魚腥草渣晾干后依次用10000ml石油醚、10000mlこ酸こ酯和10000ml 95%こ醇回流提取4h，所得提取液揮干溶劑，分別得到6. 9g棕黑色浸膏(即こ酸こ酯部位)、14. Sg棕褐色浸膏(即こ醇部位)。實(shí)施例3
一種魚腥草有效部位，其選自魚腥草揮發(fā)油、魚腥草こ酸こ酯部位和魚腥草こ醇部位中的ー種或兩種以上的混合物。所述魚腥草有效部位的提取方法包括下述步驟取500g粉碎過的魚腥草全草置于燒瓶中(燒瓶中可放入數(shù)粒沸石)，加4000ml水振搖混合后浸泡IOh左右，然后將魚腥草及浸泡液進(jìn)行水蒸氣蒸餾(保持微沸10h)，收集蒸餾液。蒸餾液靜置冷卻分層后，取上層的淡黃色油層(約0. 4ml)即得魚腥草揮發(fā)油；將用水提取過的魚腥草渣晾干后依次用9000ml石油醚、9000mlこ酸こ酯和9000ml 95%こ醇回流提取lh，所得提取液揮干溶劑，分別得到
6.2g棕黑色浸膏(即こ酸こ酯部位)、14. 4g棕褐色浸膏(即こ醇部位)。實(shí)施例2所得魚腥草有效部位的體外試驗(yàn)1.供試細(xì)胞
人肝癌細(xì)胞H印G2、人乳腺癌細(xì)胞MCF-7、人肺癌細(xì)胞A549、人淋巴瘤細(xì)胞Raji均為普通市售商品。2.主要儀器與耗材
⑴168-1000XC酶標(biāo)儀，BIORAD (美國)產(chǎn)品;
⑵JA2003A電子天平，上海精天電子儀器廠；
(3)C02培養(yǎng)箱，型號IL-161HT，施都凱儀器設(shè)備有限公司；
⑷倒置顯微鏡，型號XD-30，舜宇光學(xué)科技集團(tuán)有限公司；
(5)空氣浴恒溫?fù)u床，國華企業(yè)，ZD-85型；
(6)微量加樣器,Eppendorf(德國)公司；
(7)96孔細(xì)胞培養(yǎng)板,Greiner bio-one (德國)公司；
⑶50ml細(xì)胞培養(yǎng)瓶，Corning (美國)公司；
(9)一次性濾器，Pall corporation (美國)公司。3.主要試劑·
⑴二甲基亞砜(DMS0)，購自北京索萊寶生物醫(yī)藥科技有限公司；
⑵四甲基偶氮唑鹽(methylthiazolyl tetrazolium, MTT), Sigma (美國)公司；
⑶胎牛血清，購自杭州四季青生物工程材料有限公司；
(4)1640培養(yǎng)基，購自北京索萊寶生物醫(yī)藥科技有限公司；
(5)胰蛋白酶，Gibco公司產(chǎn)品。4.方法
4.1細(xì)胞培養(yǎng)
人肝癌細(xì)胞H印G2、人肺癌細(xì)胞A549為貼壁細(xì)胞，用含10%胎牛血清RPMI 1640培養(yǎng)基于37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2天換液I次，3 5d傳代培養(yǎng)。人乳腺癌細(xì)胞MCF-7為貼壁細(xì)胞，用含10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基于37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2天換液I次，3 5d傳代培養(yǎng)。貼壁細(xì)胞的傳代培養(yǎng)步驟倒掉舊培養(yǎng)基，加入3ml PBS緩沖液洗去殘留的舊培養(yǎng)基，向培養(yǎng)瓶加入Iml胰蛋白酶，蓋好瓶蓋后在倒置顯微鏡下觀察，當(dāng)細(xì)胞收回突起變圓時(shí)將胰蛋白酶倒掉，加入Iml新鮮含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基，反復(fù)吹打消化好的細(xì)胞使其脫壁并分散，分裝到新培養(yǎng)瓶中，加入5ml含10%胎牛血清RPMI 1640培養(yǎng)基，于37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。人淋巴瘤細(xì)胞Raji為懸浮細(xì)胞，用含10%胎牛血清RPMI 1640培養(yǎng)基，于37°C、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2天換液I次，3 5d傳代培養(yǎng)。懸浮細(xì)胞的傳代培養(yǎng)步驟吸出細(xì)胞培養(yǎng)液，放入離心管中，IOOOrpm離心5分鐘，吸掉上清液，加入Iml含10%胎牛血清RPMI1640培養(yǎng)基，混勻后轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)瓶中，加入5ml含10%胎牛血清RPMI 1640培養(yǎng)基，于37 °C、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。4. 2 MTT法體外篩選抗腫瘤藥物
取對數(shù)生長期細(xì)胞接種于96微孔板，密度為2 X IO4個(gè)/ml (100 VL/孔)。培養(yǎng)24小時(shí)后，加入不同濃度藥物的RPMI 1640或DMEM培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)。正常對照組細(xì)胞加入含0. 1% DMSO的RPMI 1640或DMEM培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)。72小時(shí)后，每孔加入20 μ 的ΜΤΤ，37° C、5%C02環(huán)境下孵育4小時(shí)。然后每孔加入200 μ 的DMSO來溶解甲瓚。用全自動(dòng)酶標(biāo)儀檢測在490 nm處的吸光度(A)值。細(xì)胞增殖抑制率(％) =[ 1_(實(shí)驗(yàn)組A490/正常對照組A490) X 100%]。
5.結(jié)果
5.1魚腥草揮發(fā)油對各細(xì)胞系72h體外抑制活性結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種魚腥草有效部位，其特征在于，選自魚腥草揮發(fā)油、魚腥草こ酸こ酯部位和魚腥草こ醇部位中的ー種或兩種以上的混合物。
2.權(quán)利要求1所述魚腥草有效部位的提取方法，其特征在于，包括下述步驟將用水浸泡過的魚腥草進(jìn)行水蒸氣蒸餾，收集蒸餾液，蒸餾液靜置冷卻分層后，取上層的油層即得魚腥草揮發(fā)油；將用水提取過的魚腥草渣晾干或烘干后依次用石油醚、こ酸こ酯和こ醇回流提取，提取液揮干溶劑后即分別得到魚腥草こ酸こ酯部位和魚腥草こ醇部位。
3.如權(quán)利2所述魚腥草有效部位的提取方法，其特征在干，將魚腥草粉碎后，用魚腥草重量8 — 15倍的水浸泡8 一 15h，然后將魚腥草及浸泡液進(jìn)行水蒸氣蒸餾，蒸餾時(shí)間6 —10h。
4.如權(quán)利2所述魚腥草有效部位的提取方法，其特征在于，將用水提取過的魚腥草渣晾干或烘干后依次用15 — 20倍的石油醚、こ酸こ酯和95%こ醇回流提取I 一 4h。
5.權(quán)利要求1所述魚腥草有效部位在制備抗腫瘤藥物方面的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種魚腥草有效部位，其選自魚腥草揮發(fā)油、魚腥草乙酸乙酯部位和魚腥草乙醇部位中的一種或兩種以上的混合物。所述魚腥草有效部位的提取方法包括下述步驟將用水浸泡過的魚腥草進(jìn)行水蒸氣蒸餾，收集蒸餾液，蒸餾液靜置冷卻分層后，取上層的油層即得魚腥草揮發(fā)油；將用水提取過的魚腥草渣晾干或烘干后依次用石油醚、乙酸乙酯和乙醇回流提取，提取液揮干溶劑后即分別得到魚腥草乙酸乙酯部位和魚腥草乙醇部位。該魚腥草有效部位對人肝癌細(xì)胞HepG2、人乳腺癌細(xì)胞MCF-7、人肺癌細(xì)胞A549及人淋巴瘤細(xì)胞Raji均有較好的抗腫瘤效果，可用于制備抗腫瘤藥物。
文檔編號A61K36/78GK103055006SQ20131004516
公開日2013年4月24日 申請日期2013年2月5日 優(yōu)先權(quán)日2013年2月5日
發(fā)明者張壯麗, 鄭立運(yùn), 趙志鴻, 張小俊, 王桂芳, 張長征, 陳慧平, 鄒敏, 張艷, 王寧, 馬方, 王東陽, 王慶端, 江金花, 王陸巡, 趙寧 申請人:河南省醫(yī)藥科學(xué)研究院