專利名稱：一種活性多糖產(chǎn)品加工工藝優(yōu)化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于天然產(chǎn)物制備方法領(lǐng)域，更具體涉及一種活性多糖產(chǎn)品加工工藝的優(yōu)化方法。
背景技術(shù)：
長期以來，人們認(rèn)為糖類在生物體內(nèi)的作用主要是作為能量源或作為結(jié)構(gòu)材料， 但大量實驗證明，多糖及其綴合物與細(xì)胞各種生命現(xiàn)象的調(diào)節(jié)有著密切的聯(lián)系。從植物、動物和微生物等不同生物體所獲得的活性多糖具有各自不同的多種藥用生物活性，活性多糖能提高人體免疫力和治療多種疾病，具有良好的應(yīng)用前景，活性多糖基礎(chǔ)研究及產(chǎn)品開發(fā)已越來越引起人們的廣泛關(guān)注。目前對多糖藥用生理活性的基礎(chǔ)研究、多糖加工工藝條件的探討雖有很多報道，但相關(guān)藥用生理活性研究缺乏對供試材料制備條件與活性試驗結(jié)果聯(lián)系的探討；加工工藝的探討僅限于以多糖得率為評價指標(biāo)優(yōu)化其提取工藝，以多糖保存率和蛋白脫除率為評價指標(biāo)優(yōu)化脫蛋白工藝。部分脫蛋白研究雖引入了活性評價指標(biāo)，但對脫蛋白前粗多糖適宜獲取條件、活性多糖的組成等缺乏系統(tǒng)研究，在實際工作中，往往因為提取和脫蛋白工藝選擇不當(dāng)，導(dǎo)致制備的多糖活性大大降低。因此，由于不同的工藝會影響多糖生物活性的保持，從活性多糖質(zhì)量可控和經(jīng)濟(jì)、高效開發(fā)產(chǎn)品的角度，建立科學(xué)合理的多糖提取、加工工藝綜合評價體系，成為促進(jìn)多糖活性組分利用產(chǎn)品開發(fā)和廣泛應(yīng)用的關(guān)鍵因素。

發(fā)明內(nèi)容
為改善目前活性多糖產(chǎn)品開發(fā)加工工藝評價和選擇缺乏合理科學(xué)的方法，導(dǎo)致活性多糖產(chǎn)品質(zhì)量管理混亂，產(chǎn)品開發(fā)和廣泛應(yīng)用受到制約的現(xiàn)狀，本發(fā)明通過引入活性跟蹤技術(shù)，將多糖得率和活性保持綜合評價應(yīng)用于活性多糖提取工藝的條件試驗過程；將多糖保存率、蛋白脫除率和活性保持綜合評價應(yīng)用于活性多糖的脫蛋白純化條件試驗過程， 提出科學(xué)合理的活性多糖生產(chǎn)工藝優(yōu)化方法。該方法簡單易行，能夠最大程度的保留制備出來的多糖的活性，并使具有活性的多糖樣品的提取率達(dá)到最大化，保證多糖的提取率和生物活性保持率均在一個較高的水平。本發(fā)明是通過如下技術(shù)方案實施的
一種活性多糖產(chǎn)品加工工藝優(yōu)化方法包括如下步驟
1)、根據(jù)多糖產(chǎn)品最主要的標(biāo)示生物活性選擇生物活性試驗方法；
2)、對原料進(jìn)行預(yù)處理；
3)、以常用的水提醇沉工藝為基礎(chǔ)，選擇增效提取手段，對溫度、時間、功率、pH進(jìn)行單因素試驗和正交試驗，以步驟1)所選擇的生物活性試驗方法，測定設(shè)計試驗所得各多糖樣品的生物活性，以提取物得率、生物活性檢測值綜合評分得分高的工藝條件，作為活性多糖的優(yōu)化提取條件；
4)、依步驟3)選擇的優(yōu)化提取條件提取的多糖樣品進(jìn)行脫蛋白工藝條件試驗；以步驟1)所選擇的生物活性試驗方法，測定各脫蛋白工藝條件試驗所得多糖樣品的生物活性，以多糖保持率、蛋白脫除率和生物活性檢測值綜合評分得分高的工藝條件，作為活性多糖的優(yōu)化脫蛋白工藝條件；
所述步驟3)的提取物得率、生物活性檢測值綜合評分得分高是指評分時以各指標(biāo)的最大值為參照將數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化，再給出不同的權(quán)重，提取物得率的權(quán)重系數(shù)為0. 4，生物活性檢測值的權(quán)重系數(shù)為0. 6，加權(quán)求和計算得分，得最高分；
所述步驟4)的多糖保持率、蛋白脫除率和生物活性檢測值綜合評分得分高是指評分時以各指標(biāo)的最大值為參照將數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化，再給出不同的權(quán)重，多糖保存率的權(quán)重系數(shù)為0. 3，生物活性檢測值的權(quán)重系數(shù)設(shè)為0. 3、蛋白脫除率的權(quán)重系數(shù)設(shè)為0. 4，加權(quán)求和計算得分，得最高分。所述步驟1)的標(biāo)示生物活性包括抗腫瘤活性、抗病毒活性、抗氧化活性。所述步驟1)的生物活性試驗方法包括采用TBA法測定多糖抗小鼠肝組織脂質(zhì)過氧化作用、根據(jù)Griess反應(yīng)測定細(xì)胞培養(yǎng)上清液的NO2—量，間接反映巨噬細(xì)胞的NO生成量，判斷多糖抗脂質(zhì)過氧化、細(xì)胞免疫及抗腫瘤活性的高低。所述步驟2)的預(yù)處理步驟選自凍融破壁工藝、乙醇浸提除去脂溶性成分工藝。所述步驟3)的增效提取手段選自微波、超聲波。所述步驟4)脫蛋白的方法選自Sevag法、酶法、三氯乙酸法和等電點法。除蛋白后的多糖樣品可進(jìn)一步進(jìn)行純化，所述純化方法選自纖維素柱層析、葡聚糖凝膠柱層析和膜透析。選擇纖維素柱層析、葡聚糖凝膠柱層析，分析層析洗脫液的蛋白洗脫曲線和糖洗脫曲線，結(jié)合各洗脫峰活性多糖活性跟蹤試驗，解析生物活性檢測值高且含量較高之分離部多糖的組成特征，測定主要活性組分多糖的分子量，為工藝評價和產(chǎn)品質(zhì)量控制方法的提出提供依據(jù)。本發(fā)明的優(yōu)點為采用本發(fā)明提出的技術(shù)方法，可以方便、快速、合理的實施活性多糖提取工藝條件和脫蛋白純化工藝條件的探索，評價和選擇活性多糖的加工工藝，實現(xiàn)高質(zhì)、高效開發(fā)生產(chǎn)出具有不同原料活性的多糖產(chǎn)品，在能很好保持多糖生物活性的基礎(chǔ)上，又使制備的茶樹菇多糖的得率在一個較高的水平，與現(xiàn)有技術(shù)以多糖得率為指標(biāo)優(yōu)選提取工藝并獲得多糖后，將多糖樣品進(jìn)行活性認(rèn)定試驗的工藝研究方法想比較，本發(fā)明可以有效的避免由于加工工藝不當(dāng)，造成加工過程中活性成分的大量丟失。


圖1為一種活性多糖產(chǎn)品加工工藝優(yōu)化方法技術(shù)路線圖； 圖2為螺旋藻活性多糖微波提取正交試驗因素水平表；
圖3為螺旋藻活性多糖L9 (34)正交試驗設(shè)計表及結(jié)果；
圖4為螺旋藻活性多糖綜合評分方差分析表，注=Fatl5(2. 2) =19.0；
圖5為不同脫蛋白處理工藝對螺旋藻活性提取物多糖保存率、蛋白脫除率及活性的影響。
具體實施方式
①確定多糖產(chǎn)品主要標(biāo)示活性不同種類的生物體材料，其活性多糖產(chǎn)品特征藥理活性存在差異，應(yīng)根據(jù)材料的特點和現(xiàn)有基礎(chǔ)藥理研究已明確的藥用生物活性，定位產(chǎn)品的主要標(biāo)示活性(如抗腫瘤、提高免疫力、抗氧化等)。②選擇適宜的活性試驗方法根據(jù)產(chǎn)品主要標(biāo)示活性，選擇可靠、方便的活性試驗方法(如采用TBA法測定多糖抗小鼠肝組織脂質(zhì)過氧化作用、根據(jù)Griess反應(yīng)測定細(xì)胞培養(yǎng)上清液的NO2—量，間接反映巨噬細(xì)胞的NO生成量等，考察多糖抗脂質(zhì)過氧化、細(xì)胞免疫及抗腫瘤活性)。③原材料提取物主要標(biāo)示活性的認(rèn)定將原材料在中性、50°C溫度條件下，經(jīng)水提醇沉獲得活性粗多糖樣品，通過活性試驗明確活性提取物的生物活性。④原料預(yù)處理不同活性多糖產(chǎn)品其共存組分具有不同的特點，應(yīng)根據(jù)活性多糖產(chǎn)品生產(chǎn)原材料的不同特點及多糖組成、生產(chǎn)工藝的不同，選擇差異化的預(yù)處理工藝(如凍融破壁、采用乙醇等溶劑除去脂溶性成分等)，在保證材料活性多糖生物活性的前提下，為高效率的提取、純化并得到活性多糖創(chuàng)造有利條件。⑤提取工藝條件的單因素試驗和正交試驗以常用的水提醇沉工藝為基礎(chǔ)，根據(jù)材料的特點，選擇微波、超聲波作為高效提取的手段，通過單因素試驗分別考察溫度、時間、 功率、PH等對提取過程的影響，確定正交試驗的因素和水平，以多糖提取率和活性試驗值綜合評分，以得分最高著為適宜的提取工藝，以選擇的適宜提取工藝條件加工獲得活性多糖
工業(yè)產(chǎn)品。⑥脫蛋白純化試驗采用不同脫蛋白工藝(如kvag法、酶法法聯(lián)用、三氯乙酸法、三氯乙酸法與Sevag法聯(lián)用、等電點法)對活性多糖工業(yè)產(chǎn)品進(jìn)行脫蛋白處理，以多糖保持率、蛋白脫除率和生物活性指標(biāo)值進(jìn)行綜合評價，以得分最高者為適宜的脫蛋白工藝，以試驗確定的脫蛋白工藝對活性多糖工業(yè)產(chǎn)品進(jìn)行脫蛋白處理，形成脫蛋白活性多糖工業(yè)產(chǎn)品。⑦解析主要質(zhì)量指標(biāo)成分，實現(xiàn)生產(chǎn)過程控制活性試驗跟蹤條件下，將優(yōu)選工藝條件制備的脫蛋白活性多糖樣品透析出去小分子，纖維素、葡聚糖凝膠柱層析純化，通過解析柱層析洗脫液蛋白洗脫曲線和糖洗脫曲線，明確產(chǎn)品主要質(zhì)量指標(biāo)成分的組成、分子量， 通過分析不同批次產(chǎn)品主要質(zhì)量指標(biāo)成分，實現(xiàn)生產(chǎn)過程控制。實施例1
以螺旋藻活性多糖為例
1)、稱取螺旋藻鮮藻500g，加IOOOmL水?dāng)噭?，于_20°C凍融處理2次，加鮮藻3倍量的水后，依正交試驗設(shè)計的因素和水平，分別調(diào)節(jié)溶液PH 8-10,400-1000w微波提取4-8min 后(見圖2)，4000rpm離心15min，棄沉淀，取上清液；
2)、取1)所得正交試驗各上清液樣，減壓濃縮至1/3體積，加入3倍量95%乙醇，4°C靜置M!，4(KK)rpm離心15min，得各沉淀分離樣，測定各沉淀分離樣活性提取物得率和抗肝組織脂質(zhì)過氧化活性，綜合評價確定優(yōu)化提取條件，相關(guān)試驗結(jié)果見圖3、圖4 ；以優(yōu)化條件提取制備活性提取物，冷凍干燥即得螺旋藻活性多糖；該螺旋藻活性多糖其主要活性成分是分子量分別為100000和9500的結(jié)合蛋白多糖，其中100000多糖含量> 9. 38%，分子量為 9500的多糖含量彡22. 12%ο3)、取2)優(yōu)化條件下制備所得螺旋藻上清液，快速攪拌下緩慢加入粉末狀固體硫酸銨，使硫酸銨濃度達(dá)10%，沉淀部分蛋白，4000rpm離心15min，棄沉淀(去除的蛋白可復(fù)性利用)，取上清液；
4)、取3)所得上清液，分別以Sevag法一次、Sevag法四次、三氯乙酸法、酶法進(jìn)行脫蛋白處理，4000rpm離心15min后，測定各脫蛋白樣多糖保存率、蛋白脫除率和抗肝組織脂質(zhì)過氧化活性，綜合評價確定優(yōu)化脫蛋白工藝條件；以優(yōu)化工藝條件對3)所得上清液進(jìn)行脫蛋白處理經(jīng)試驗后所選擇的最終條件為將3)所得上清液減壓濃縮至1/3體積，與氯仿-正丁醇混合液(氯仿正丁醇=4:1)等體積混合后，劇烈震蕩5min，靜置濁后，4000rpm 離心15min，離心液加3倍體積95%乙醇，醇析Mh，4000rpm離心15min，丙酮洗滌沉淀， 沉淀冷凍干燥即得脫蛋白螺旋藻活性多糖。該脫蛋白螺旋藻活性多糖主要活性成分是的分子量分別為100000和9500的結(jié)合蛋白多糖，其中分子量100000的結(jié)合蛋白多糖含量彡19. 51%，分子量為9500結(jié)合蛋白多糖含量彡46. 02%。相關(guān)結(jié)果見圖4。分別測定螺旋藻活性提取物總量和提取物抗肝組織脂質(zhì)過氧化活性，計算螺旋藻活性提取物得率和抑制率，進(jìn)行多指標(biāo)綜合評分。評分時以各指標(biāo)的最大值為參照將數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化，再給出不同的權(quán)重。提取物得率的權(quán)重系數(shù)設(shè)為0. 4，抑制率的權(quán)重系數(shù)設(shè)為 0. 6，以綜合分進(jìn)行統(tǒng)計分析，結(jié)果見圖3、圖4。其中綜合評分Y=O. 4 X 100 / 0. 2037 + 0. 6 X 100 / 0. 4189，公式 1); 綜合比較三種工藝，確定微波提取提取溶液pH10、400w、處理4 min為優(yōu)選工藝。對于脫蛋白的工藝選擇，見圖5，參考公式1的計算方式，由計算結(jié)果可知，脫蛋白方法選擇Sevag法1次操作具有較高的多糖保存率和很好的蛋白脫除率，且抗肝組織脂質(zhì)過氧化活性能得到很好的保持，故選擇kvag法1次操作作為脫蛋白螺旋藻活性提取物的脫蛋白加工工藝。以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例，凡依本發(fā)明申請專利范圍所做的均等變化與修飾，皆應(yīng)屬本發(fā)明的涵蓋范圍。
權(quán)利要求
1.一種活性多糖產(chǎn)品加工工藝優(yōu)化方法，其特征在于所述優(yōu)化方法包括如下步驟1)、根據(jù)多糖產(chǎn)品最主要的標(biāo)示生物活性選擇生物活性試驗方法；2)、對原料進(jìn)行預(yù)處理；3)、以常用的水提醇沉工藝為基礎(chǔ)，選擇增效提取手段，對溫度、時間、功率、pH進(jìn)行單因素試驗和正交試驗，以步驟1)所選擇的生物活性試驗方法，測定設(shè)計試驗所得各多糖樣品的生物活性，以提取物得率、生物活性檢測值綜合評分得分高的工藝條件，作為活性多糖的優(yōu)化提取條件；4)、依步驟3)選擇的優(yōu)化提取條件提取的多糖樣品進(jìn)行脫蛋白工藝條件試驗；以步驟 1)所選擇的生物活性試驗方法，測定各脫蛋白工藝條件試驗所得多糖樣品的生物活性，以多糖保持率、蛋白脫除率和生物活性檢測值綜合評分得分高的工藝條件，作為活性多糖的優(yōu)化脫蛋白工藝條件。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種活性多糖產(chǎn)品加工工藝優(yōu)化方法，其特征在于所述步驟3)的提取物得率、生物活性檢測值綜合評分得分高是指評分時以各指標(biāo)的最大值為參照將數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化，再給出不同的權(quán)重，提取物得率的權(quán)重系數(shù)為0.4，生物活性檢測值的權(quán)重系數(shù)為0. 6，加權(quán)求和計算得分，得最高分。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種活性多糖產(chǎn)品加工工藝優(yōu)化方法，其特征在于所述步驟4)的多糖保持率、蛋白脫除率和生物活性檢測值綜合評分得分高是指評分時以各指標(biāo)的最大值為參照將數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化，再給出不同的權(quán)重，多糖保存率的權(quán)重系數(shù)為0. 3，生物活性檢測值的權(quán)重系數(shù)為0. 3、蛋白脫除率的權(quán)重系數(shù)為0. 4，加權(quán)求和計算得分，得最高分。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種活性多糖產(chǎn)品加工工藝優(yōu)化方法，其特征在于所述步驟1)的標(biāo)示生物活性包括抗腫瘤活性、抗病毒活性、抗氧化活性。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種活性多糖產(chǎn)品加工工藝優(yōu)化方法，其特征在于所述步驟1)的生物活性試驗方法包括采用TBA法測定多糖抗小鼠肝組織脂質(zhì)過氧化作用、根據(jù) Griess反應(yīng)測定細(xì)胞培養(yǎng)上清液的NO2—量，間接反映巨噬細(xì)胞的NO生成量，判斷多糖抗脂質(zhì)過氧化、細(xì)胞免疫及抗腫瘤活性的高低。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種活性多糖產(chǎn)品加工工藝優(yōu)化方法，其特征在于所述步驟2)的預(yù)處理步驟選自凍融破壁工藝、乙醇浸提除去脂溶性成分工藝。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種活性多糖產(chǎn)品加工工藝優(yōu)化方法，其特征在于所述步驟3)的增效提取手段選自微波、超聲波。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種活性多糖產(chǎn)品加工工藝優(yōu)化方法，其特征在于所述步驟4)脫蛋白的方法選自Sevag法、酶法、三氯乙酸法和等電點法。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種活性多糖產(chǎn)品加工工藝優(yōu)化方法，該方法通過引入活性跟蹤技術(shù)，將多糖得率和活性保持綜合評價應(yīng)用于活性多糖提取工藝的條件試驗過程；將多糖保存率、蛋白脫除率和活性保持綜合評價應(yīng)用于活性多糖的脫蛋白純化條件試驗過程；通過纖維素、葡聚糖凝膠柱層析，對脫蛋白活性多糖產(chǎn)品進(jìn)行純化分離過程研究，活性試驗跟蹤，了解主要活性分離部各峰的組成、多糖分子量，實現(xiàn)生產(chǎn)過程質(zhì)量控制，提出科學(xué)合理的活性多糖生產(chǎn)工藝優(yōu)化方法。采用本發(fā)明提出的技術(shù)方法，可以方便、快速、合理的實施活性多糖提取工藝條件和脫蛋白純化工藝條件的探索，評價和選擇活性多糖的加工工藝，實現(xiàn)高質(zhì)、高效開發(fā)生產(chǎn)不同原料活性多糖產(chǎn)品。
文檔編號A61P35/00GK102295708SQ20111016378
公開日2011年12月28日 申請日期2011年6月17日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月17日
發(fā)明者俞白楠, 葉舟, 呂千, 呂楊蘭, 康彥斌, 汪世華, 黃碧芳 申請人:福建農(nóng)林大學(xué)