專利名稱：叢枝菌根真菌孢子的表面消毒方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種表面消毒方法，具體是一種叢枝菌根真菌孢子的表面消毒方法， 屬于微生物培養(yǎng)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
叢枝菌根真菌(AMF)是一類不能純培養(yǎng)的植物共生菌，在對AMF非共生階段及生理生化的研究中往往需要對其孢子進行表面消毒以排除其他微生物的干擾。由于AMF的孢子具有貼壁的特性，在一般的器具中它們往往貼伏在器壁上，很難使其完全浸沒在消毒液中，從而不能很好的消毒。目前最為常用的AMF孢子表面消毒方法有“Kitasato beaker”法和“Eppendorf surface sterilized”法。"Kitasato beaker”法由英國禾斗學家 Mosse 在《Transactions of the British Mycological Society)) 1959 年 42 :273-286 “Theregular germination of resting spores and some observations on the growthrequirements of an Endogone sp.causing vesicular-arbuscular mycorrhiza"中提出，是一種基于抽濾系統(tǒng)進行消毒的方法，通過不斷添加消毒液使孢子始終浸在消毒液中來達到孢子表面消毒的目的，該方法雖具有較好的消毒效果，但其操作復(fù)雜且需要專門儀器的輔助，如真空泵和專門的無菌罩，另外該方法操作區(qū)域較大會損失大量孢子；"Eppendorf surface sterilized”法由西 Ι 31 禾Cano 《Mycorrhiza》2008 $ V :627_654 “In vitro culturesopen new prospects for basic research in arbuscular mycorrhizas，，中提出，是一禾中通過離來實現(xiàn)孢子表面消毒的方法，該方法是將孢子轉(zhuǎn)移到裝有消毒液的Eppendorf管中，通過離心在離心力的作用下使孢子浸沒在消毒液中實現(xiàn)表面消毒的，這種消毒方法需要離心機的輔助，雖然在一定程度上能實現(xiàn)AMF孢子的表面消毒，但由于操作比較劇烈，表面消毒后孢子的活力會降低。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明為實現(xiàn)AMF孢子的表面消毒，使消毒過程不致造成孢子的損失同時又不影響孢子的活力，公開了一種AMF孢子的表面消毒方法。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方法實現(xiàn)的a.取兩張濾紙將其邊緣上折后鋪入其中一個培養(yǎng)皿內(nèi)，裁剪一些吸水紙放入其它幾個培養(yǎng)皿內(nèi)，另留二個空培養(yǎng)皿不放濾紙與吸水紙，將培養(yǎng)皿包嚴，備用蒸餾水，對培養(yǎng)皿和蒸餾水進行高壓蒸汽滅菌；b.配制含有氯胺T、氯霉素、硫酸慶大霉素、硫酸鏈霉素和吐溫-20共5種試劑的孢子表面消毒液，將消毒液通過微孔濾膜過濾除菌；c.打開裝有雙層濾紙的培養(yǎng)皿，將載有AMF孢子的濾紙片放入培養(yǎng)皿內(nèi)的雙層濾紙中間，用膠頭滴管吸取消毒液滴加在上層濾紙上，使整個雙層濾紙浸透并在上層可見消毒液，將培養(yǎng)皿封蓋；
d.消毒過程中如需更換消毒液，可通過轉(zhuǎn)移雙層濾紙至裝有吸水紙的培養(yǎng)皿內(nèi)吸取消毒液，再轉(zhuǎn)至另一套空培養(yǎng)皿中重新添加消毒液；e.在消毒完成后，將雙層濾紙轉(zhuǎn)移到裝有吸水紙的培養(yǎng)皿中，用吸水紙吸取雙層濾紙所吸附的消毒液；f.轉(zhuǎn)移雙層濾紙至裝有吸水紙的另一培養(yǎng)皿中，用膠頭滴管在上層濾紙中添加無菌水，利用吸水紙吸取水分，重復(fù)操作3-5次；g.取出上層濾紙并倒置放入另一培養(yǎng)皿中，解剖鏡下分別檢查并轉(zhuǎn)移上層濾紙、 下層濾紙和濾紙片上的AMF孢子，AMF孢子的表面消毒完成。本發(fā)明通過雙層濾紙和培養(yǎng)皿的組合實現(xiàn)了對AMF孢子的表面消毒。該方法操作簡單溫和、消毒液用量少，消毒前后不會丟失孢子，也不影響孢子的活力，同時消毒過程中也不需要其他儀器的輔助。


附圖1是本發(fā)明AMF孢子表面消毒示意圖。附圖2是本發(fā)明表面消毒后用無菌水清洗AMF孢子的示意圖。附圖標記為膠頭滴管1，消毒液2，上層濾紙3，孢子4，濾紙片5，培養(yǎng)皿6，下層濾紙7，無菌水8，吸水紙9。
具體實施例方式以下結(jié)合附圖對本發(fā)明做進一步詳細描述a.備用10套60mm的玻璃培養(yǎng)皿、直徑為75mm的普通濾紙和吸水紙，取兩張濾紙將其邊緣上折后鋪入培養(yǎng)皿底，其上折的邊緣與培養(yǎng)皿壁留有空隙以便轉(zhuǎn)移，裁剪一些吸水紙，大小剛好放入培養(yǎng)皿底，4張一組放入培養(yǎng)皿內(nèi)，共放置7套培養(yǎng)皿，另留二套空培養(yǎng)皿以備轉(zhuǎn)移雙層濾紙，將培養(yǎng)皿包嚴，備用200ml蒸餾水和2支膠頭滴管，對培養(yǎng)皿、蒸餾水和膠頭滴管在121°C下高壓蒸汽滅菌20min ；b.配制含有50g/L氯胺T、50mg/L氯霉素、100mg/L硫酸慶大霉素、200mg/L硫酸鏈霉素和0. 05 %吐溫-20的孢子表面消毒液20mL，將消毒液通過0. 22 μ m ？L徑的微孔濾膜過濾除菌；c.整個孢子表面消毒過程在室溫條件下，放置于超凈工作臺上進行，打開裝有雙層濾紙的培養(yǎng)皿，將載有孢子的濾紙片放入培養(yǎng)皿內(nèi)的兩層濾紙正中，用膠頭滴管吸取消毒液從一側(cè)開始滴加在雙層濾紙的上層濾紙上，使整個雙層濾紙浸透并在上層可見消毒液，封蓋培養(yǎng)皿，消毒液滴加過程中避免產(chǎn)生氣泡；d.消毒過程中如需更換消毒液，可通過轉(zhuǎn)移雙層濾紙至裝有吸水紙的培養(yǎng)皿內(nèi)吸走消毒液，再轉(zhuǎn)至另一套空培養(yǎng)皿中重新添加消毒液來實現(xiàn)；e.消毒時間為15min，消毒完成后，將雙層濾紙轉(zhuǎn)移到裝有吸水紙的培養(yǎng)皿中，用吸水紙吸取濾紙吸附的消毒液；f.轉(zhuǎn)移雙層濾紙至裝有吸水紙的另一培養(yǎng)皿中，用另一個膠頭滴管在上層濾紙表面添加無菌水，利用吸水紙從下層濾紙吸收水分，重復(fù)操作5次；&取出上層濾紙并倒置放入另一套培養(yǎng)皿內(nèi)，解剖鏡下分別檢查并轉(zhuǎn)移上層濾紙、下層濾紙及濾紙片上的AMF孢子，AMF孢子的表面消毒完成。
權(quán)利要求
1.叢枝菌根真菌孢子的表面消毒方法，其特征在于是通過以下技術(shù)方法實現(xiàn)的 1. a.取兩張濾紙將其邊緣上折后鋪入其中一個培養(yǎng)皿內(nèi)，裁剪一些吸水紙放入其它幾個培養(yǎng)皿內(nèi)，另留二個空培養(yǎng)皿不放濾紙與吸水紙，將培養(yǎng)皿包嚴，備用蒸餾水，對培養(yǎng)皿和蒸餾水進行高壓蒸汽滅菌；1. b.配制含有氯胺T、氯霉素、硫酸慶大霉素、硫酸鏈霉素和吐溫-20共5種試劑的孢子表面消毒液，將消毒液通過微孔濾膜過濾除菌；1. c.打開裝有雙層濾紙的培養(yǎng)皿，將載有AMF孢子的濾紙片放入培養(yǎng)皿內(nèi)的雙層濾紙中間，用膠頭滴管吸取消毒液滴加在上層濾紙上，使整個雙層濾紙浸透并在上層可見消毒液，將培養(yǎng)皿封蓋；1. d.消毒過程中如需更換消毒液，可通過轉(zhuǎn)移雙層濾紙至裝有吸水紙的培養(yǎng)皿內(nèi)吸取消毒液，再轉(zhuǎn)至另一套空培養(yǎng)皿中重新添加消毒液；1. e.在消毒完成后，將雙層濾紙轉(zhuǎn)移到裝有吸水紙的培養(yǎng)皿中，用吸水紙吸取雙層濾紙所吸附的消毒液；1. f.轉(zhuǎn)移雙層濾紙至裝有吸水紙的另一培養(yǎng)皿中，用膠頭滴管在上層濾紙中添加無菌水，利用吸水紙吸取水分，重復(fù)操作3-5次；1.g.取出上層濾紙并倒置放入另一培養(yǎng)皿中，解剖鏡下分別檢查并轉(zhuǎn)移上層濾紙、下層濾紙和濾紙片上的AMF孢子，AMF孢子的表面消毒完成。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的叢枝菌根真菌孢子的表面消毒方法，其特征在于是通過以下技術(shù)方法實現(xiàn)的2. a.備用10套60mm的玻璃培養(yǎng)皿、直徑為75mm的普通濾紙和吸水紙，取兩張濾紙將其邊緣上折后鋪入培養(yǎng)皿底，其上折的邊緣與培養(yǎng)皿壁留有空隙以便轉(zhuǎn)移，裁剪一些吸水紙，大小剛好放入培養(yǎng)皿底，4張一組放入培養(yǎng)皿內(nèi)，共放置7套培養(yǎng)皿，另留二套空培養(yǎng)皿以備轉(zhuǎn)移雙層濾紙，將培養(yǎng)皿包嚴，備用200ml蒸餾水和2支膠頭滴管，對培養(yǎng)皿、蒸餾水和膠頭滴管在121°C下高壓蒸汽滅菌20min ；2. b.配制含有50g/L氯胺T、50mg/L氯霉素、100mg/L硫酸慶大霉素、200mg/L硫酸鏈霉素和0. 05 %吐溫-20的孢子表面消毒液20mL，將消毒液通過0. 22 μ m孔徑的微孔濾膜過濾除菌；2. c.整個孢子表面消毒過程在室溫條件下，放置于超凈工作臺上進行，打開裝有雙層濾紙的培養(yǎng)皿，將載有孢子的濾紙片放入培養(yǎng)皿內(nèi)的兩層濾紙正中，用膠頭滴管吸取消毒液從一側(cè)開始滴加在雙層濾紙的上層濾紙上，使整個雙層濾紙浸透并在上層可見消毒液， 封蓋培養(yǎng)皿，消毒液滴加過程中避免產(chǎn)生氣泡；2. d.消毒過程中如需更換消毒液，可通過轉(zhuǎn)移雙層濾紙至裝有吸水紙的培養(yǎng)皿內(nèi)吸走消毒液，再轉(zhuǎn)至另一套空培養(yǎng)皿中重新添加消毒液來實現(xiàn)；2. e.消毒時間為15min，消毒完成后，將雙層濾紙轉(zhuǎn)移到裝有吸水紙的培養(yǎng)皿中，用吸水紙吸取濾紙吸附的消毒液；2. f.轉(zhuǎn)移雙層濾紙至裝有吸水紙的另一培養(yǎng)皿中，用另一個膠頭滴管在上層濾紙表面添加無菌水，利用吸水紙從下層濾紙吸收水分，重復(fù)操作5次；2. g.取出上層濾紙并倒置放入另一套培養(yǎng)皿內(nèi)，解剖鏡下分別檢查并轉(zhuǎn)移上層濾紙、 下層濾紙及濾紙片上的AMF孢子，AMF孢子的表面消毒完成。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種叢枝菌根真菌孢子的表面消毒方法，其技術(shù)方案是將濾紙與吸水紙分別放入幾個培養(yǎng)皿內(nèi)，配制孢子表面消毒液，將載有AMF孢子的濾紙片放入培養(yǎng)皿內(nèi)的雙層濾紙中間，吸取消毒液滴加在上層濾紙上，將雙層濾紙轉(zhuǎn)移到裝有吸水紙的培養(yǎng)皿中，用吸水紙吸取所吸附的消毒液，取出上層濾紙并倒置放入另一培養(yǎng)皿中，轉(zhuǎn)移濾紙上的AMF孢子，完成表面消毒。本發(fā)明通過雙層濾紙和培養(yǎng)皿的組合實現(xiàn)了對AMF孢子的表面消毒。該方法操作簡單溫和，消毒液用量少，消毒前后不會丟失孢子，也不影響孢子的活力，同時也不需要其他儀器的輔助。
文檔編號A61L101/32GK102166367SQ20101061713
公開日2011年8月31日 申請日期2010年12月30日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月30日
發(fā)明者唐明, 孫學廣, 陳輝 申請人:西北農(nóng)林科技大學