專利名稱：一種細(xì)胞片層智能脫附水凝膠及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)工程和智能高分子材料領(lǐng)域，具體涉及ー種細(xì)胞片層智能脫附水凝膠及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
長期以來，供體緊缺和移植排斥反應(yīng)是器官移植發(fā)展的兩大障礙。目前使用的天然材料與人工合成支架材料因強(qiáng)度低和降解產(chǎn)生炎癥等問題導(dǎo)致其臨床應(yīng)用療效欠佳。細(xì)胞片層技術(shù)是組織工程中收獲種子細(xì)胞的ー項(xiàng)新技術(shù)，無需支架即可成功移植，避免了傳統(tǒng)支架材料移植后引發(fā)的免疫源性、誘發(fā)炎癥反應(yīng)、光學(xué)干渉等問題。
細(xì)胞片層(Cell Sheet)醫(yī)療是將患者自身的細(xì)胞取出后在培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，然后將増殖成的片層移植于患部，促使患部器官再生的技木。當(dāng)細(xì)胞片層貼在因重病或重傷而導(dǎo)致功能無法恢復(fù)的器官上時(shí)，被稱為細(xì)胞因子的相當(dāng)于生長激素的物質(zhì)便會從細(xì)胞片層中分泌出來，促使毛細(xì)血管擴(kuò)張，受損的細(xì)胞將復(fù)活重現(xiàn)。由于它是患者自身的細(xì)胞，因此不產(chǎn)生排斥反應(yīng)。通過細(xì)胞片層技術(shù)能使糖尿病、牙周病、肺氣漏、肝功能障礙和關(guān)節(jié)功能障礙等病的患者得到治愈的可能性大大提高。中國專利CN101896600A公開了ー種圖案化的細(xì)胞片層和其生產(chǎn)方法。所述方法包括步驟提供布置在基底上的連續(xù)的細(xì)胞片層，所述基底包含形狀轉(zhuǎn)變性質(zhì)和/或可改變的表面特性；使所述連續(xù)的細(xì)胞片層以圖案化方式暴露于釋放劑；在暴露于所述釋放劑之后洗滌所述細(xì)胞片層，以除去已被所述釋放劑影響的細(xì)胞，和使用第二細(xì)胞類型重新填充在被所述釋放劑影響的細(xì)胞已被除去之后留下的缺ロ。聚異丙基丙烯酰胺(polyN-isopropylacrylamide, PNIPAAm)具有溫度敏感性能，其體積相轉(zhuǎn)變溫度為 32。。。Yamato等(Tissue Eng.，2001，7 :473.)將PNIPAAm接枝到細(xì)胞培養(yǎng)板表面，于37°C條件下接種上細(xì)胞，由于PNIPAAm具有疏水性，因而細(xì)胞可進(jìn)行黏附、伸展和増殖；當(dāng)降低溫度至32°C以下，PNIPAAm具有親水性，體積膨脹，細(xì)胞與培養(yǎng)板表面分離，整體細(xì)胞群則在保持細(xì)胞間連接狀態(tài)下以片狀形態(tài)脫附，從而獲得保留細(xì)胞活性的細(xì)胞片層。通過改變溫度收獲細(xì)胞片層避免了酶消化法對細(xì)胞造成的生物學(xué)功能損傷，并可直接黏附到組織上而無需縫合，同時(shí)避免了支架材料降解成分對細(xì)胞的傷害。水凝膠是由親水性聚合物鏈構(gòu)造的具有三維交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的高聚物和介質(zhì)組成的多元體系，在藥物控釋、軟組織支架構(gòu)建和細(xì)胞包載等生物醫(yī)用材料方面具有良好的應(yīng)用前景。水凝膠材料作為填充缺損型支架、生物活性分子控制釋放載體以及組織/細(xì)胞的轉(zhuǎn)載系統(tǒng)，正朝向智能化方向發(fā)展。溫度敏感水凝膠是其體積隨環(huán)境溫度變化而改變的高分子水凝膠；pH敏感水凝膠是其體積隨環(huán)境pH值變化而改變的高分子水凝膠，這類凝膠大分子網(wǎng)絡(luò)中具有可解離成離子的基團(tuán)(羧基、磺酸基或氨基)，可根據(jù)環(huán)境PH值變化奪取或釋放質(zhì)子。利用溫度或PH響應(yīng)水凝膠的軟濕特性和敏感特性，則可通過改變溫度或pH值實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的片層脫附。純的合成水凝膠細(xì)胞相容性較差，在合成水凝膠中弓I入天然生物相容性單體如膠原、殼聚糖和絲膠等，則可促進(jìn)細(xì)胞的増殖和脫附。由上分析可以看出，目前尚無將溫敏性或pH敏感性水凝膠、生物相容性高分子和細(xì)胞片層脫附技術(shù)相結(jié)合的報(bào)道。本發(fā)明綜合考慮了水凝膠的溫度或PH值敏感特性和軟濕特性，以及生物相容性高分子良好的細(xì)胞相容性，以去離子水作為溶劑，采用自由基聚合，制得可通過調(diào)節(jié)溫度或PH值實(shí)現(xiàn)細(xì)胞片層自動(dòng)脫附的水凝膠，并可應(yīng)用于皮膚、角膜上皮和牙周膜韌帶等組織和器官的治療與修復(fù)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明擬解決的技術(shù)問題是為有效促進(jìn)細(xì)胞黏附，避免傳統(tǒng)的酶解法對細(xì)胞活性和功能等造成的損傷，同時(shí)降低與傳統(tǒng)組織工程相關(guān)的并發(fā)癥，如炎癥反應(yīng)等，提供可應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)工程的ー種細(xì)胞片層智能脫附水凝膠，該水凝膠既具有良好的生物相容性，能促進(jìn)細(xì)胞快速増殖，又具有優(yōu)異的溫度或PH值響應(yīng)性能，僅通過改變溫度或pH值凝膠便可快速在親水性和疏水性之間變化，從而實(shí)現(xiàn)細(xì)胞増殖和脫附的智能調(diào)控。本發(fā)明的ー種細(xì)胞片層智能脫附水凝膠，由功能単體Ml、化學(xué)或物理交聯(lián)劑M2和水溶性生物高分子M3溶于溶劑M4中采用氧化還原引發(fā)體系進(jìn)行自由基聚合而成，所述的Ml、M2、M3 和 M4 的質(zhì)量百分比為 Ml :8-15%, M2 :1-10%, M3 :1-15%, M4 :60-90%，改變溫 度或PH值后細(xì)胞從水凝膠表面脫附，形成片層結(jié)構(gòu)。所述的Ml具有溫度敏感性或pH值敏感性，為N-異丙基丙烯酰胺或N，N’ -雙こ基丙烯酰胺或雙こ氧基丙烯酰胺或甲基丙烯酸N，N-ニ甲氨基こ酯或丙烯酸或甲基丙烯酸或衣康酸中的ー種，以及其共混物。所述的M2是化學(xué)交聯(lián)劑或物理交聯(lián)劑，為N，N’ -亞甲基雙丙烯酰胺或ニ甲基丙烯酸こニ醇酯或哌臻丙烯酰胺或戊ニ醛或鋰皂石或鎂皂石或鋅皂石或硅酸鎂鋰中的ー種，以及其混合物。所述的M3是水溶性生物高分子，為淀粉或羧甲基纖維素鈉或海藻酸鈉或殼聚糖或腐植酸鈉或明膠或瓜兒膠或聚こ烯吡咯烷酮或β-環(huán)糊精或絲膠蛋白中的ー種，以及其混合物。所述的Μ4為去離子水。所述的水凝膠脫附細(xì)胞為小鼠成纖細(xì)胞或角膜細(xì)胞或骨骼肌細(xì)胞或骨髄間充質(zhì)干細(xì)胞或皮膚纖維原細(xì)胞或人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞或大鼠胰島細(xì)胞或牙周膜干細(xì)胞中的ー種。所述的水凝膠在溫度為3_15°C或pH值為2-5時(shí)增殖的細(xì)胞從水凝膠表面迅速脫附，形成細(xì)胞片層。所述的水凝膠智能脫附后的細(xì)胞片層植入受區(qū)位點(diǎn)、通過同型或異型細(xì)胞片層的疊加而構(gòu)建三維結(jié)構(gòu)的組織。所述的水凝膠智能脫附后的細(xì)胞片層在皮膚、角膜上皮和牙周膜韌帶組織或器官的治療與修復(fù)中的應(yīng)用。本發(fā)明的原理是溫敏或pH值響應(yīng)水凝膠具有良好的溫度和pH值敏感性，在環(huán)境溫度分別高于或低于相轉(zhuǎn)變溫度或臨界PH值時(shí)，凝膠會發(fā)生親疏水的變化，其體積發(fā)生收縮或溶脹現(xiàn)象。高溫或低PH值時(shí)，由于疏水基團(tuán)起主導(dǎo)作用或酸根離子質(zhì)子化，凝膠宏觀表現(xiàn)為體積收縮，同時(shí)由于水凝膠含有生物相容性高分子，細(xì)胞在凝膠表面快速黏附、鋪展、増殖達(dá)到一定的數(shù)量后，將環(huán)境溫度降到相轉(zhuǎn)變溫度以下或環(huán)境PH值升到臨界pH值以上，這時(shí)凝膠體積膨脹，貼附在凝膠表面的細(xì)胞自動(dòng)脫附，從而得到具有高活性的細(xì)胞片層，轉(zhuǎn)載至皮膚等組織缺損處可快速増殖。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果(I)本發(fā)明可用于細(xì)胞片層智能脫附的水凝膠成分簡單，操作方便，具有優(yōu)良的溫度或PH值響應(yīng)特性，以及生物相容性，可有效促進(jìn)細(xì)胞的快速增殖和脫附。(2)水凝膠的細(xì)胞相容性和細(xì)胞増殖或脫附速率可通過單體投料比、交聯(lián)度和反應(yīng)溫度等來調(diào)控?！?3)細(xì)胞片層脫附簡便易行，僅僅通過控制溫度或pH值就可以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的自動(dòng)脫附，從而避免了傳統(tǒng)的酶解法對細(xì)胞活性、功能等造成的損傷。(4)獲得的細(xì)胞片層保留了完整細(xì)胞外基質(zhì)，不需支架材料，通過相同或不同的細(xì)胞片層相互層疊而獲得全細(xì)胞的三維組織，克服了傳統(tǒng)組織工程支架降解的弊端，在牙周和皮膚組織再生等領(lǐng)域具有良好的應(yīng)用前景。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)ー步詳細(xì)闡述。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍，其他的任何未違背本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。實(shí)施例Iー種細(xì)胞片層智能脫附水凝膠，由N-異丙基丙烯酰胺、N，N’ -亞甲基雙丙烯酰胺和羧甲基纖維素鈉溶于去離子水中采用過硫酸氨/四甲基こニ胺引發(fā)體系進(jìn)行自由基聚合而成，所述的異丙基丙烯酰胺、N，N’ -亞甲基雙丙烯酰胺、羧甲基纖維素鈉和去離子水的質(zhì)量百分比為80%，降低水凝膠環(huán)境溫度為5°C，増殖7天的皮膚纖維原細(xì)胞從水凝膠表面脫附，形成片層結(jié)構(gòu)。脫附后的皮膚纖維原細(xì)胞片層可用于燒燙傷皮膚表皮的治療與修復(fù)。實(shí)施例2—種細(xì)胞片層智能脫附水凝膠，由N-異丙基丙烯酰胺、鋰皂石和海藻酸鈉溶于去離子水中采用過硫酸氨/四甲基こニ胺引發(fā)體系進(jìn)行自由基聚合而成，所述的異丙基丙烯酰胺、鋰皂石、海藻酸鈉和去離子水的質(zhì)量百分比為11%，降低水凝膠環(huán)境溫度為4°C，増殖7天的角膜細(xì)胞從水凝膠表面脫附，形成片層結(jié)構(gòu)。脫附后的角膜細(xì)胞片層可用于角膜的治療與修復(fù)。實(shí)施例3ー種細(xì)胞片層智能脫附水凝膠，由甲基丙烯酸N，N-ニ甲氨基こ酷、ニ甲基丙烯酸こニ醇酯和腐植酸鈉溶于去離子水中采用過硫酸氨/四甲基こニ胺引發(fā)體系進(jìn)行自由基聚合而成，所述的甲基丙烯酸N，N-ニ甲氨基こ酷、ニ甲基丙烯酸こニ醇酯、腐植酸鈉和去離子水的質(zhì)量百分比為8%，3%，4%，85%,降低水凝膠環(huán)境溫度為3°C，増殖7天的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞從水凝膠表面脫附，形成片層結(jié)構(gòu)。脫附后的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞片層可用于硬皮病的治療與修復(fù)。實(shí)施例4
ー種細(xì)胞片層智能脫附水凝膠，由N，N’ -雙こ基丙烯酰胺、ニ甲基丙烯酸こニ醇酯和聚こ烯吡咯烷酮溶于去離子水中采用過硫酸氨/四甲基こニ胺引發(fā)體系進(jìn)行自由基聚合而成，所述的N，N’ -雙こ基丙烯酰胺、ニ甲基丙烯酸こニ醇酯、聚こ烯吡咯烷酮和去離子水的質(zhì)量百分比為10 %，4%，6 %，80%，降低水凝膠環(huán)境溫度為4°C，増殖7天的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞從水凝膠表面脫附，形成片層結(jié)構(gòu)。脫附后的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞片層可用于心肌組織的治療與修復(fù)。實(shí)施例5ー種細(xì)胞片層智能脫附水凝膠，由異丙基丙烯酰胺和丙烯酸(質(zhì)量比為3 I)的共混物、N，N’ -亞甲基雙丙烯酰胺/鋰皂石的混合物和絲膠蛋白溶于去離子水中采用過硫酸氨/四甲基こニ胺引發(fā)體系進(jìn)行自由基聚合而成，所述的異丙基丙烯酰胺和丙烯酸的共混物、N，N’ -亞甲基雙丙烯酰胺、絲膠蛋白和去離子水的質(zhì)量百分比為12%，6%，12%，80%，降低水凝膠環(huán)境溫度為5°C，増殖7天的牙周膜干細(xì)胞從水凝膠表面脫附，形成片層結(jié)構(gòu)。脫附后的牙周膜干細(xì)胞片層可用于牙周炎的治療與修復(fù)。 實(shí)施例6ー種細(xì)胞片層智能脫附水凝膠，由甲基丙烯酸N，N-ニ甲氨基こ酯和甲基丙烯酸的共混物(質(zhì)量比為4 I)、N，N’-亞甲基雙丙烯酰胺和殼聚糖溶于去離子水中采用過硫酸氨/四甲基こニ胺引發(fā)體系進(jìn)行自由基聚合而成，所述的甲基丙烯酸N，N- ニ甲氨基こ酯和甲基丙烯酸的共混物、N, N’ -亞甲基雙丙烯酰胺、殼聚糖和去離子水的質(zhì)量百分比為14%,8%, 3%, 75%,降低水凝膠環(huán)境溫度為3°C，増殖7天的皮膚纖維原細(xì)胞從水凝膠表面脫附，形成片層結(jié)構(gòu)。脫附后的皮膚纖維原細(xì)胞片層可用于燒燙傷皮膚表皮的治療與修復(fù)。
權(quán)利要求
1.ー種細(xì)胞片層智能脫附水凝膠及其應(yīng)用，其特征在于由功能単體Ml、化學(xué)或物理交聯(lián)劑M2和水溶性生物高分子M3溶于溶劑M4中采用氧化還原引發(fā)體系進(jìn)行自由基聚合而成，所述的Ml、M2、M3和M4的質(zhì)量百分比為Ml :8-15%, M2 :1-10%, M3M4 60-90%,改變溫度或pH值后細(xì)胞從水凝膠表面脫附，形成片層結(jié)構(gòu)。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的ー種細(xì)胞片層智能脫附水凝膠，其特征在于所述的Ml具有溫度敏感性或pH值敏感性，為N-異丙基丙烯酰胺或N，N’ -雙こ基丙烯酰胺或雙こ氧基丙烯酰胺或甲基丙烯酸N，N-ニ甲氨基こ酯或丙烯酸或甲基丙烯酸或衣康酸中的ー種，以及其共混物。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的ー種細(xì)胞片層智能脫附水凝膠，其特征在于所述的M2是化學(xué)交聯(lián)劑或物理交聯(lián)劑，為N，N’ -亞甲基雙丙烯酰胺或ニ甲基丙烯酸こニ醇酯或哌臻丙烯酰胺或戊ニ醛或鋰皂石或鎂皂石或鋅皂石或硅酸鎂鋰中的ー種，以及其混合物。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的ー種細(xì)胞片層智能脫附水凝膠，其特征在于所述的M3是水溶性生物高分子，為淀粉或羧甲基纖維素鈉或海藻酸鈉或殼聚糖或腐植酸鈉或明膠或瓜兒膠或聚こ烯吡咯烷酮或β -環(huán)糊精或絲膠蛋白中的ー種，以及其混合物。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的ー種細(xì)胞片層智能脫附水凝膠，其特征在于所述的Μ4為去離子水。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的ー種細(xì)胞片層智能脫附水凝膠，其特征在于所述的水凝膠脫附細(xì)胞為小鼠成纖細(xì)胞或角膜細(xì)胞或骨骼肌細(xì)胞或骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞或皮膚纖維原細(xì)胞或人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞或大鼠胰島細(xì)胞或牙周膜干細(xì)胞中的ー種。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的ー種細(xì)胞片層智能脫附水凝膠，其特征在于所述的水凝膠在溫度為3-15°C或pH值為2-5時(shí)增殖的細(xì)胞從水凝膠表面迅速脫附，形成細(xì)胞片層。
8.根據(jù)權(quán)利要求I所述的ー種細(xì)胞片層智能脫附水凝膠，其特征在于所述的水凝膠智能脫附后的細(xì)胞片層植入受區(qū)位點(diǎn)、通過同型或異型細(xì)胞片層的疊加而構(gòu)建三維結(jié)構(gòu)的組織。
9.根據(jù)權(quán)利要求I所述的ー種細(xì)胞片層智能脫附水凝膠及其應(yīng)用，其特征在于所述的水凝膠智能脫附后的細(xì)胞片層在皮膚、角膜上皮和牙周膜韌帶組織或器官的治療與修復(fù)中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種細(xì)胞片層智能脫附水凝膠及其應(yīng)用。所述水凝膠由功能單體M1、化學(xué)或物理交聯(lián)劑M2和水溶性生物高分子M3溶于溶劑M4中采用氧化還原引發(fā)體系進(jìn)行自由基聚合而成，所述的M1、M2、M3和M4的質(zhì)量百分比為M15-10％，M22-10％，M31-15％，M475-92％。該水凝膠具有優(yōu)良的溫度或pH值響應(yīng)特性，以及生物相容性，可有效促進(jìn)細(xì)胞的快速增殖和脫附。脫附后形成的細(xì)胞片層保留了完整細(xì)胞外基質(zhì)，避免了酶解法對細(xì)胞造成的生物學(xué)功能損傷和支架材料降解成分對細(xì)胞的傷害。本發(fā)明的水凝膠智能脫附后的細(xì)胞片層可用于皮膚、角膜上皮和牙周膜韌帶相關(guān)組織和器官的治療與修復(fù)。
文檔編號A61L27/52GK102718928SQ201210228270
公開日2012年10月10日 申請日期2012年7月4日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月4日
發(fā)明者張青松, 王小召, 董盼盼, 陳莉, 魯思 申請人:天津工業(yè)大學(xué)