專利名稱：山奈酚及其衍生物用于制備防治心腦血管疾病藥物的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，是山奈酚及其衍生物用于制備防治心腦血管疾病藥物的用途。
本發(fā)明用作藥理和藥效試驗(yàn)的化合物有山奈酚、6-羥基山奈酚、山奈酚-3-葡萄糖苷、山奈酚-3-蕓香糖苷、6-羥基山奈酚-3-葡萄糖苷、6-羥基山奈酚-3，6-二葡萄糖苷、6-羥基山奈酚-3，6，7-三葡萄糖苷等，都取得了良好的效果。這些化合物均含有母環(huán)山奈酚結(jié)構(gòu)，其他山奈酚衍生物也含有母環(huán)山奈酚結(jié)構(gòu)，它們的化學(xué)結(jié)構(gòu)通式為 其中R1，R2，R3，R4和R5分別代表R1H，甲基，乙?；?，羥乙基，葡萄糖基，鼠李糖基，鼠李葡糖基，葡糖鼠李糖基；R2H，甲基，乙酰基，羥乙基，葡萄糖基，鼠李糖基，鼠李葡糖基，葡糖鼠李糖基，半乳糖基，葡糖醛(苷)酸基，阿拉伯糖基，木糖基，3，4，5-三羥苯甲酰葡萄糖基，香豆酰阿拉伯糖基，阿魏酰阿拉伯糖基；R3H，甲基，乙?；?，羥乙基；R4H，OH，甲氧基，-O-葡萄糖，-O-葡萄糖基，-O-鼠李糖基，-O-鼠李葡糖基，-O-葡糖鼠李糖基，-O-半乳糖基，-O-葡糖醛(苷)酸基，-O-阿拉伯糖基；R5H，甲基，乙?；u乙基，葡萄糖基，鼠李糖基，鼠李葡糖基，葡糖鼠李糖基。
山奈酚及其部分衍生物化學(xué)結(jié)構(gòu)式已經(jīng)確定，其母環(huán)上各R基團(tuán)見表1
表1山奈酚及其部分衍生物化學(xué)結(jié)構(gòu)式母環(huán)上各R基團(tuán)

其中，編號(hào)為4的化合物山奈酚-3-蕓香糖苷本發(fā)明人已另案申請(qǐng)專利(專利申請(qǐng)?zhí)枮?1131942.9，申請(qǐng)日2001.10.22)可選用紅花、五加、銀杏、燈盞花、風(fēng)仙花等植物作為制備山奈酚及其衍生物的原料，但由于以往所用的原料單體含量較低，故不能制備到足夠的單一化合物。本發(fā)明則選用合肥紅花、毫州紅花為原料，其山奈酚及其衍生物的含量高，因而單體得率高。制備方法通常為按常規(guī)將原料用極性溶劑提取，制備植物提取液的濃縮液，將濃縮液進(jìn)行多種柱層析，然后以不同極性溶劑依次洗脫，分別收集各化合物的洗脫液，經(jīng)純化后進(jìn)行濃縮干燥或重結(jié)晶，即可獲得所需化合物。
1、將乙醚萃取物進(jìn)行硅膠柱層析，按常規(guī)以石油醚-乙酸乙酯(30∶1-1∶1)及氯仿-甲醇(10∶1-1∶1，下同)溶劑系統(tǒng)洗脫，分別收集氯仿-甲醇8∶1和5∶1的洗脫液，并各用Sephadex LH-20柱純化，再濃縮和重結(jié)晶，分別得山奈酚120mg，6-羥基山奈酚100mg；2、將正丁醇萃取物過大孔樹脂柱，依次以水、20％、50％、70％、95％乙醇洗脫，棄水洗脫液，分別收集不同濃度乙醇洗脫液。
①將20％乙醇洗脫液進(jìn)行硅膠柱層析，以氯仿-甲醇溶劑系統(tǒng)洗脫，分別收集氯仿-甲醇6∶1和4∶1洗脫液，并各用Sephadex LH-20柱純化，再濃縮和重結(jié)晶，分別得山奈酚-3-葡萄糖苷1360mg，山奈酚-3-蕓香糖苷2600mg；②將50％乙醇洗脫液進(jìn)行硅膠柱層析，以氯仿-甲醇溶劑系統(tǒng)洗脫，分別收集氯仿-甲醇5∶1、3∶1和2∶1洗脫液，各用Sephadex LH-20柱純化，濃縮和重結(jié)晶，分別得6-羥基山奈酚-3-葡萄糖苷407mg；6-羥基山奈酚-3，6-二葡萄糖苷299mg；6-羥基山奈酚-3，6，7-三葡萄糖苷260mg。
藥理、藥效實(shí)驗(yàn)根據(jù)治療缺血性中風(fēng)(缺血性腦血管病)中藥新藥研制的藥效學(xué)要求(中華人民共和國(guó)藥政局中藥新藥研究指南，第66～67頁(yè)，準(zhǔn)印證號(hào)京準(zhǔn)字94-0198)，設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方法。上述各化合物藥理或藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)的方法基本相同，以山奈酚-3-葡萄糖苷(FNL)、6-羥基山奈酚-3-葡萄糖苷(LNS)為例詳述如下一、FNL、LNS對(duì)大鼠局灶性腦缺血的治療作用1、試驗(yàn)材料1.1、實(shí)驗(yàn)儀器SW-30射頻雙極凝固器(上海市檢測(cè)技術(shù)所檢測(cè)儀器廠生產(chǎn))，307-6臺(tái)式牙鉆車(上海齒科醫(yī)械廠生產(chǎn))，SXP-1B手術(shù)顯微鏡(上海醫(yī)用光學(xué)儀器廠生產(chǎn))，恒溫水浴。1.2、供試樣品FNL，LNS，純度均大于93.2％。
配制臨用前將FNL、LNS溶于乙醇∶吐溫-80∶H2O為1∶1∶8的溶劑中待用。2、試驗(yàn)動(dòng)物品系Wistar大鼠性別雄性體重260～290克來源中科院上海動(dòng)物中心(下同)動(dòng)物合格證滬動(dòng)合證字005號(hào)飼養(yǎng)恒溫凈化通風(fēng)動(dòng)物房，自由進(jìn)食與飲水，25±2℃。3、試驗(yàn)方法取健康雄性Wistar大鼠，共72只，隨機(jī)分成8組第1組為陰性對(duì)照組(注射等體積溶劑)，第2、3、4組為FNL組，給藥劑量分別為每公斤體重5mg、10mg、20mg(以下用mg/kg表示)，第5、6、7組為L(zhǎng)NS組，給藥劑量分別為5mg/kg、10mg/kg、20mg/kg，第8組為陽(yáng)性對(duì)照組(尼莫地平)，給藥劑量1.2mg/kg。給藥時(shí)間為缺血后立即尾靜脈注射，給藥體積為1ml。
按Tamura的方法(Tumura A，et alJ Cereb Blood Flow and Metab，1981，153)制備腦缺血模型，并于術(shù)后24小時(shí)進(jìn)行行為學(xué)評(píng)分，評(píng)分采用單盲法，在大鼠右側(cè)大腦中動(dòng)脈阻斷24小時(shí)，斷頭取腦，在顯微鏡下進(jìn)一步確證右側(cè)大腦中動(dòng)脈已在嗅束與大腦下靜脈之間燒斷且腦實(shí)質(zhì)無(wú)損害者，將其進(jìn)行切片染色，分別稱壞死區(qū)及大腦右半球重量。4、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理所有的數(shù)據(jù)均用X±SD表示，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析用t檢驗(yàn)(詳見金丕煥主編醫(yī)用統(tǒng)計(jì)方法學(xué)，上海醫(yī)科大學(xué)出版社，1993年2月第1版，第36～40頁(yè))。5、實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2
表2 FNL、LNS對(duì)中動(dòng)脈結(jié)扎大鼠的組織學(xué)和行為學(xué)影響劑量 行為學(xué)評(píng)分大腦右半球重壞死區(qū)重 壞死百分率組別 藥物動(dòng)物數(shù)(mg/Kg) (24h) (g) (g)(％)1溶劑 9 7.67±1.58 0.758±0.0230.134±0.062 17.65±7.912FNL 5.0 9 7.67±2.50 0.784±0.0230.139±0.047 16.82±7.313FNL 10.09 5.21±1.83*0.781±0.0260.073±0.022*9.37±4.31*4FNL 20.09 4.83±1.83*0.789±0.0450.053±0.025*6.73±3.29**5LNS 5.0 9 7.17±2.30 0.791±0.0270.139±0.041 17.57±6.916LNS 10.09 4.91±1.81*0.762±0.0300.071±0.019*9.31±4.14*7LNS 20.09 4.63±1.53*0.794±0.0270.048±0.038*6.05±3.22**8尼莫地平 1.2 9 6.21±1.83*0.771±0.0260.081±0.022*10.51±3.91*與陰性對(duì)照組比較*P＜0.05，**P＜0.01從表2可以看出，與陰性對(duì)照組相比，F(xiàn)NL、LNS在10～20mg/kg劑量時(shí)，能明顯改善局部性腦缺血大鼠的神經(jīng)行為學(xué)缺陷(P＜0.05)，顯著縮小局部性腦缺血大鼠的壞死腦組織重量(P＜0.05)，減少局部性腦缺血大鼠的腦梗死重量占腦半球重量的百分比(P＜0.01)。6、結(jié)論從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，F(xiàn)NL和LNS于缺血后立即靜脈注射給藥能明顯改善局部性腦缺血大鼠的神經(jīng)行為學(xué)缺陷，顯著縮小局部性腦缺血大鼠的壞死腦組織重量，減少局部性腦缺血大鼠的腦梗死重量占腦半球重量的百分比。表明FNL和LNS對(duì)急性局部性腦缺血能發(fā)揮很好的治療作用。二、FNL、LNS對(duì)大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用1、試驗(yàn)材料(1)激光多普勒血流測(cè)定儀(瑞典Perimed公司生產(chǎn)的Periflux4001型)、SXP-1B手術(shù)顯微鏡(上海醫(yī)用光學(xué)儀器廠)，SW-30射頻雙極電凝器(上海市檢測(cè)技術(shù)所檢測(cè)儀器廠生產(chǎn))。
試驗(yàn)樣品FNL和LNS，配制方法同上。
(2)陽(yáng)性對(duì)照尼莫通注射液(德國(guó)拜耳公司生產(chǎn)，批號(hào)CBNXS1)。維腦路通注射液(華北制藥集團(tuán)太原有限責(zé)任公司生產(chǎn)，批號(hào)20001062)。
2、試驗(yàn)動(dòng)物品系SD大鼠性別雄性體重230～270克3、試驗(yàn)方法；取雄性SD大鼠共64只，隨機(jī)分成8組，每組8只，第1組為假手術(shù)組，第2組為溶劑組(注射等體積溶劑)，第3、4組為FNL組，給藥劑量分別為10mg/Kg、20mg/Kg，第5、6組為L(zhǎng)NS組，給藥劑量分別為10mg/Kg、20mg/Kg，第7組為尼莫通組，給藥劑量2mg/Kg，第8組為維腦路通組，給藥劑量30mg/Kg。給藥時(shí)間為缺血后立即股靜脈注射，給藥體積為1ml。
參照Longa EZ報(bào)道的線栓模型制備腦缺血再灌注損傷模型(Longa EZ，et alReversablemiddle cerebral artery occlusion without craniectomy in rat.Stroke，1989，2084)。缺血2小時(shí)再灌注24小時(shí)后進(jìn)行行為學(xué)評(píng)分，斷頭取腦，TTC染色，留取樣本進(jìn)行腦梗塞體積測(cè)定(詳見張均田主編現(xiàn)代藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)，第1241頁(yè)，北京醫(yī)科大學(xué)中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)聯(lián)合出版社，1998年10月第1版)。4、所有數(shù)據(jù)均采用X±SD表示，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用t檢驗(yàn)。5、實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3表3 FNL、LNS對(duì)大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用(n＝10，X±SD)劑量 腦水腫 梗塞面積組別 藥物行為評(píng)分(mg/Kg) (％) (％)1假手術(shù)組 0.00 78.01±0.81 0.002溶劑組 1.50±0.71 80.49±0.77 37.68±8.983FNL 10.0 0.50±0.53*78.78±0.78*15.21±4.74*4FNL 20.0 0.40±0.52*78.32±0.74**11.52±5.32**5LNS 10.0 0.50±0.53*78.93±0.71*14.93±4.67*6LNS 20.0 0.40±0.43*78.34±0.69**10.64±5.72**7尼莫通 2.00.80±0.71 78.99±0.68*17.47±7.17*8維腦路通30.0 0.80±0.71 79.19±0.68*22.67±6.87**P＜0.05，**P＜0.01與模型組比較從表3可以看出，F(xiàn)NL、LNS以10.0～20.0mg/Kg給藥，可顯著降低大鼠行為評(píng)分，劑量依賴性地縮小腦梗死面積，減輕缺血側(cè)腦半球水腫程度。表明FNL、LNS對(duì)大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷有較強(qiáng)保護(hù)作用。三、FNL對(duì)家兔血液流變性的影響1、動(dòng)物家兔，體重約2Kg，20只，雌雄各半，分成4組，每組5只。
2、儀器德國(guó)全自動(dòng)LBY-N6A自清洗旋轉(zhuǎn)式粘度計(jì)及其自帶的流變學(xué)軟件平臺(tái)。
3、實(shí)驗(yàn)方法家兔分別耳靜脈取血4ml，置于肝素干管中，按常規(guī)于LBY-N6A自清洗旋轉(zhuǎn)式粘度計(jì)測(cè)量家兔全血粘度、血漿粘度、全血還原粘度、紅細(xì)胞壓積，并通過粘度計(jì)自帶的流變學(xué)軟件平臺(tái)分析血沉、紅細(xì)胞聚集指數(shù)、剛性指數(shù)、變形指數(shù)、電泳指數(shù)等。給藥途徑耳靜脈注射。給藥0.5小時(shí)后，再次取血測(cè)量家兔上述各種指標(biāo)，觀察給藥前后上述各指標(biāo)的變化。FNL分兩個(gè)劑量組，給藥劑量分別10mg/Kg、20mg/Kg，陰性對(duì)照為溶劑組(注射等體積溶劑)，陽(yáng)性對(duì)照為紅花注射液，給藥劑量為2.5ml/Kg。給藥次數(shù)均單次給藥。
4、結(jié)果見表4表4 FNL對(duì)家兔血液流變性的影響

表4結(jié)果表明，F(xiàn)NL以10～20mg/kg劑量給藥，能劑量依賴性地顯著降低家兔全血粘度和全血還原粘度(P＜0.01)，并能顯著降低紅細(xì)胞聚集指數(shù)(P＜0.01)。血粘度是血液流變學(xué)的重要指標(biāo)，因此，F(xiàn)NL通過顯著降低全血粘度、全血還原粘度和紅細(xì)胞聚集指數(shù)，而有利于防治血栓形成。四、對(duì)凝血系統(tǒng)的影響1、動(dòng)物 家兔5只，購(gòu)自第二軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物房，實(shí)驗(yàn)前飼養(yǎng)1個(gè)月，體重(2.5±0.3)kg。
2、儀器與試劑 ST4Bio型半自動(dòng)血液凝固測(cè)定儀(法國(guó)Diagnostica STAGO產(chǎn)品)，抗肝素鈣凝血活酶，部分凝血活酶(上海貝特生物技術(shù)有限公司)，氯化鈣、檸檬酸鈉、戊巴比妥鈉皆為分析純國(guó)產(chǎn)試劑。
3、藥品FNL，紅花注射液(太原華衛(wèi)藥業(yè)有限公司生產(chǎn))。
4、方法家兔給藥前及給藥后0.5小時(shí)分別耳靜脈取血4ml，給藥途徑耳靜脈注射，給藥劑量FNL組10mg/Kg，陰性對(duì)照(溶劑組)2.5ml/Kg，陽(yáng)性對(duì)照(紅花注射液)，2.5ml/Kg。按常規(guī)觀察給藥前與給藥后凝血酶原和部分凝血活酶時(shí)間的變化。給藥次數(shù)單次給藥。
5、結(jié)果見表5
表5FNL對(duì)家兔凝血系統(tǒng)的影響

***P＜0.001與給藥前比較由表5看出，F(xiàn)NL能明顯延長(zhǎng)凝血酶原時(shí)間和部分凝血活酶時(shí)間，有利于防治血栓形成。五、急性毒性試驗(yàn)實(shí)驗(yàn)一單次灌胃對(duì)小鼠的急性毒性1、受試藥物FNL，配制方法臨用前用0.5％羧甲基纖維素鈉碾磨均勻，配成濃度為0.1g/ml的懸浮液。2、試驗(yàn)動(dòng)物種屬遠(yuǎn)交系ICR小鼠性別雌雄各半年齡6～8周體重18～22克數(shù)量30只，雌雄各半3、試驗(yàn)方法給藥途徑給小鼠單次灌胃，劑量1.0g/Kg、2.0g/Kg、4.0g/Kg給藥。4、結(jié)果小鼠單次灌胃給予FNL 1.0g/Kg、2.0g/Kg、4.0g/Kg后，小鼠的一般行為活動(dòng)、飲食、皮毛、糞便及其它情況均無(wú)異常，未見明顯毒性反應(yīng)。在給藥后14天內(nèi)，未引起小鼠死亡。14天后解剖給藥小鼠，肉眼觀察未見明顯病變。結(jié)果表明FNL口服具有較高的安全性。實(shí)驗(yàn)二靜脈注射對(duì)小鼠的急性毒性試驗(yàn)1、受試藥物FNL，配制方法臨用前將FNL溶于丙二醇∶土溫-80∶水為1∶1∶8的溶劑中待用。2、試驗(yàn)動(dòng)物種屬遠(yuǎn)交系ICR小鼠性別雌雄各半年齡6～8周體重18～22克數(shù)量60只，雌雄分別隨機(jī)分組，共分6組，每組10只，雌雄各半。3、試驗(yàn)方法給藥途徑小鼠尾靜脈注射，容量20ml/kg；組別第1、2、3、4、5組為FNL組，給藥劑量分別為0.9g/kg、1.06g/kg、1.25g/kg、1.45g/kg、2.00g/kg，組距0.85，第6組為溶劑組(注射等體積溶劑)觀察指標(biāo)觀察給藥后14天內(nèi)小鼠的中毒及死亡情況，未死亡小鼠于第14天稱重后處死，解剖，檢查各臟器是否有病變。用Bliss法計(jì)算靜脈注射給予復(fù)腦素對(duì)ICR小鼠的LD50及其95％可信限。4、結(jié)果死亡小鼠經(jīng)尸檢，肉眼檢查各臟器，未見明顯病變。未死亡小鼠于給藥后第14天斷頸處死，解剖，肉眼檢查各臟器未見明顯異常。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，計(jì)算得出靜脈注射給予FNL對(duì)小鼠的LD50為1.203g/kg，其95％可信限為1.041～1.363。相當(dāng)于推薦人臨床劑量3mg/kg的400倍。說明FNL靜脈注射具有較高的安全性。
權(quán)利要求
1.山奈酚及其衍生物，化學(xué)結(jié)構(gòu)通式為 其中R1，R2，R3，R4和R5基團(tuán)分別代表R1H，甲基，乙?；?，羥乙基，葡萄糖基，鼠李糖基，鼠李葡糖基，葡糖鼠李糖基；R2H，甲基，乙酰基，羥乙基，葡萄糖基，鼠李糖基，鼠李葡糖基，葡糖鼠李糖基，半乳糖基，葡糖醛(苷)酸基，阿拉伯糖基，木糖基，3，4，5-三羥苯甲酰葡萄糖基，香豆酰阿拉伯糖基，阿魏酰阿拉伯糖基；R3H，甲基，乙?；?，羥乙基；R4H，OH，甲氧基，-O-葡萄糖，-O-葡萄糖基，-O-鼠李糖基，-O-鼠李葡糖基，-O-葡糖鼠李糖基，-O-半乳糖基，-O-葡糖醛(苷)酸基，-O-阿拉伯糖基；R5H，甲基，乙酰基，羥乙基，葡萄糖基，鼠李糖基，鼠李葡糖基，葡糖鼠李糖基；其用于制備防治心腦血管疾病藥物的用途。
2.按權(quán)利要求1所述的山奈酚及其衍生物，是指山奈酚；6-羥基山奈酚；山奈酚-3-葡萄糖苷；山奈酚-3-葡糖鼠李糖苷；6-羥基山奈酚-3-葡萄糖苷；6-羥基山奈酚-3，6-二葡萄糖苷；6-羥基山奈酚-3，6，7-三葡萄糖苷；山奈酚-3，7-二鼠李糖苷；7-鼠李糖山奈酚-3-葡萄糖苷；7-葡萄糖山奈酚-3-鼠李糖苷；山奈酚-3-甲基醚；山奈酚-4’-葡萄糖苷；3-乙?；侥畏?7-葡萄糖苷；山奈酚-7-葡萄糖苷；4’-乙?；侥畏?7-葡萄糖苷；3-羥乙基山奈酚-7-鼠李糖苷；山奈酚-7，4’-二鼠李糖葡糖苷；山奈酚-5-甲基醚，7-葡萄糖苷；山奈酚-3-鼠李糖苷；山奈酚-3-阿拉伯糖苷；山奈酚-3-半乳糖糖苷；山奈酚-3-木糖苷；山奈酚-3-葡萄糖醛酸酯；山奈酚-3-香豆酰阿拉伯糖苷；山奈酚-3-阿魏酰阿拉伯糖苷；4’-羥乙基山奈酚；7-羥乙基山奈酚；7，4’-二羥乙基-山奈酚-3-蕓香糖苷；7-乙酰山奈酚；5-乙酰山奈酚；4’-甲基山奈酚-7-葡萄糖苷；山奈酚-5，4’-二葡萄糖苷；山奈酚-3-(3，4，5-三羥)苯甲酰葡萄糖苷。
全文摘要
本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，是山奈酚及其衍生物用于制備防治心腦血管疾病藥物的用途。紅花、燈盞花、銀杏葉等植物的花、葉已被用于防治心腦血管疾病，它們都含有山奈酚及其衍生物，但未見用這些化合物制備防治心腦血管疾病藥物的報(bào)道。本發(fā)明經(jīng)系統(tǒng)藥理和藥效試驗(yàn)，證明山奈酚及其衍生物單體有防治心腦血管疾病的作用，故可用于制備防治心腦血管疾病的藥物。
文檔編號(hào)A61K31/325GK1403080SQ02137548
公開日2003年3月19日 申請(qǐng)日期2002年10月21日 優(yōu)先權(quán)日2002年10月21日
發(fā)明者郭美麗, 張戈 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)