專(zhuān)利名稱(chēng)：一種魚(yú)類(lèi)廣譜弧菌亞單位疫苗及制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種魚(yú)類(lèi)廣譜弧菌亞單位疫苗及制備方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
近年來(lái)，人工魚(yú)類(lèi)養(yǎng)殖規(guī)模迅速擴(kuò)大，生產(chǎn)集約化程度不斷提高。病害已經(jīng)成為制約水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展的瓶頸。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖病害發(fā)病率達(dá)50%以上，損失率30% 左右，每年直接損失高達(dá)百億元之巨。在眾多的細(xì)菌性病害中，弧菌病被公認(rèn)為是魚(yú)類(lèi)養(yǎng)殖中最為嚴(yán)重的病害之一。主要的致病性弧菌包括副溶血弧菌、溶藻膠弧菌、哈維氏弧菌、鰻弧菌和創(chuàng)傷弧菌。隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖微生物病害的施虐，濫用抗生素的狀況也愈發(fā)嚴(yán)重?？股貧埩粢鸬氖称钒踩珕?wèn)題事關(guān)人們的身體健康和民生大事，已引起各國(guó)政府高度重視的問(wèn)題。高效廣譜弧菌疫苗的研發(fā)和應(yīng)用有利于減少抗生素的濫用，保證水產(chǎn)品的食品安全；同時(shí)可以防治致病微生物的感染，減少水產(chǎn)養(yǎng)殖病害發(fā)病率。目前國(guó)外有近30多種商品化的魚(yú)用疫苗。我國(guó)魚(yú)用疫苗的研究起步較晚，獲得國(guó)家新獸藥證書(shū)的水產(chǎn)疫苗僅有3種，分別為草魚(yú)出血病細(xì)胞滅活疫苗、嗜水氣單胞菌病滅活疫苗以及牙鲆魚(yú)溶藻弧菌、鰻弧菌、遲緩愛(ài)德華菌病多聯(lián)抗獨(dú)特型抗體疫苗。目前并沒(méi)有一種有效地能夠防治多種致病性弧菌對(duì)魚(yú)類(lèi)感染的疫苗。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種魚(yú)類(lèi)廣譜弧菌亞單位疫苗及制備方法，該疫苗疫苗具廣譜性，可用于防治多種致病性弧菌引起的魚(yú)類(lèi)弧菌病。本發(fā)明首先提供了一種魚(yú)類(lèi)廣譜弧菌亞單位疫苗，所述疫苗以副溶血弧菌外膜蛋白OmpK和鞭毛蛋白FlaA的融合蛋白FlaA-OmpK作為抗原成分?？乖煞譃镕laA和OmpK 通過(guò)連接肽Gly4Ser相連成重組融合蛋白FlaA-OmpK ；重組融合蛋白FlaA-OmpK的氨基酸序列如SEQ. NO. 1所示。其中OmpK是主要的抗原成分。副溶血弧菌外膜蛋白OmpK與其他主要致病弧菌的外膜蛋白K的同源性高達(dá)95%以上。FlaA-OmpK亞單位疫苗具有良好的廣譜性，誘發(fā)產(chǎn)生的抗OmpK抗體對(duì)多種致病性弧菌(副溶血弧菌、溶藻膠弧菌、哈維氏弧菌、鰻弧菌和創(chuàng)傷弧菌)具有良好的交叉反應(yīng)性，可用于防治多種致病性弧菌(付溶血弧菌、溶藻膠弧菌、哈維氏弧菌、鰻弧菌和創(chuàng)傷弧菌)對(duì)魚(yú)類(lèi)的感染。鞭毛蛋白FlaA能夠激活魚(yú)腸道粘膜的TLR5受體，進(jìn)而激活機(jī)體先天性免疫系統(tǒng)， 具有增強(qiáng)免疫效果的佐劑作用。融和蛋白FLaA-OmpK具有很強(qiáng)的免疫原性，誘發(fā)有效抗體的作用明顯強(qiáng)于蛋白混合物FLaA + OmpK以及蛋白OmpK。本發(fā)明的魚(yú)類(lèi)廣譜弧菌亞單位疫苗誘發(fā)的抗體對(duì)于副溶血弧菌、溶藻膠弧菌、哈維氏弧菌、鰻弧菌和創(chuàng)傷弧菌具有良好的交叉反應(yīng)性，可用于防治副溶血弧菌、溶藻膠弧菌、哈維氏弧菌、鰻弧菌和創(chuàng)傷弧菌對(duì)魚(yú)類(lèi)的感染。
所述疫苗的類(lèi)型為腹腔注射疫苗或口服腸溶微球疫苗，免疫方式為腹腔注射免疫或口服免疫。腹腔注射免疫時(shí)，疫苗為重組融合蛋白FlaA-OmpK的生理鹽水溶液，免疫劑量為80-100 μ g/次，按IOOg體重計(jì)；口服免疫時(shí)，將口服腸溶微球疫苗摻合餌料中，自然攝食，免疫劑量為80-200 μ g/天，按IOOg體重計(jì)，連續(xù)2-4天口服免疫。所述口服腸溶微球疫苗，采用丙烯酸樹(shù)脂包裹融合蛋白FlaA-OmpK，使其具有腸溶功能，同時(shí)所制備的口服疫苗為微球狀，粒徑10 - 50nm。所述口服腸溶微球疫苗的制備方法，包括如下步驟
(1)融合蛋白FlaA-OmpKIOOmg溶于20mL TE_buffer中，10_30g丙烯酸樹(shù)脂II號(hào)溶于 250mL乙醇中，這兩種溶液在攪拌條件下混合均勻，作為內(nèi)油相；
(2)內(nèi)油相在lOOOOr/min攪拌條件下緩慢加入IOOOmL液體石蠟，所述液體石蠟含 0. 1-1. OmL卵磷脂和0. 1-0.6% Span80，乳化30min后，改為常規(guī)攪拌600r/min，持續(xù)攪拌至乙醇完全揮發(fā)，微球固化；
(3)離心收集微球顆粒，用乙醇洗滌數(shù)次，60°C干燥4h，即得口服腸溶微球疫苗。按照魚(yú)的個(gè)體重量和攝食習(xí)慣，將所需劑量的口服腸溶疫苗微球與粉狀魚(yú)飼料按一定的比例混合，擠壓成型，即可直接投料喂養(yǎng)，達(dá)到口服免疫效果。所述融合蛋白FlaA-OmpK的制備包括如下步驟
(1)以副溶血弧菌的DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，分別獲得目標(biāo)基因/7W和
(2)采用重疊延伸PCR技術(shù)，獲得融合蛋白基因flaA-ompK；
(3)選用表達(dá)載體ρΕΤ48ει，構(gòu)建重組質(zhì)粒flaA-omPK—m-2^i；轉(zhuǎn)入感受態(tài)大腸桿菌BL21，篩選轉(zhuǎn)化子；在IPTG誘導(dǎo)下表達(dá)目標(biāo)蛋白；經(jīng)鎳柱親和層析法純化得到融合蛋白 FlaA-OmpK0本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)
1、本發(fā)明構(gòu)建副溶血弧菌外膜蛋白OmpK和鞭毛蛋白FLaA的融合蛋白FLaA-OmpK，并以融合蛋白作為疫苗的抗原成分。融和蛋白FLaA-OmpK誘發(fā)有效抗體的作用顯著強(qiáng)于蛋白混合物Flaw+ OmpK。在相同免疫劑量(100 μ g/100g體重)的條件下，融和蛋白FLaA-OmpK 免疫組產(chǎn)生的有效抗體的效價(jià)是混合蛋白FLaA + OmpK免疫組的4倍。2,OmpK是主要抗原成分。副溶血弧菌外膜蛋白OmpK與其他主要致病弧菌的外膜蛋白K的同源性高達(dá)95%以上。FLaA-OmpK亞單位疫苗具廣譜性，可應(yīng)用于防治包括副溶血弧菌、溶藻弧菌、哈維氏弧菌，鰻弧菌和創(chuàng)傷弧菌等同源性較高的致病弧菌引起的魚(yú)類(lèi)弧菌病。3、鞭毛蛋白FlaA能夠激活魚(yú)腸道粘膜的TLR5受體，進(jìn)而激活機(jī)體先天性免疫系統(tǒng)，從而顯著增強(qiáng)魚(yú)類(lèi)機(jī)體對(duì)弧菌的抵抗能力。FlaA作為抗原成分，具有明顯的增強(qiáng)免疫效果的佐劑作用。在相同免疫劑量(100yg/100g體重)的條件下，F(xiàn)LaA-OmpK組(不含佐劑)產(chǎn)生的抗OmpK抗體滴度明顯高于OmpK組(含有增強(qiáng)佐劑)。4、本發(fā)明所制備的FLaA-OmpK亞單位疫苗，可通過(guò)注射或口服方式進(jìn)行給藥免疫。口服疫苗采用丙烯酸樹(shù)脂II號(hào)包裹融合蛋白FLaA-OmpK，具有腸溶功能，避免了胃蛋白酶的降解作用?？诜⑶蛞呙缌?0 - 50nm，其中10 — 30nm的粒子占70%以上，有利于魚(yú)腸后段對(duì)微球的吸收。


圖1為PCR擴(kuò)增flaA和產(chǎn)物電泳分析圖；1- ompk PCR擴(kuò)增產(chǎn)物 2-flaA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物3-Marker。圖2為PCR擴(kuò)增融合基因flaA-ompK產(chǎn)物電泳分析圖；Marker，2 一 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
具體實(shí)施例方式以下所用生化試劑如無(wú)特別提及，均為常規(guī)試劑。實(shí)施例1 FlaA-OmpK亞單位疫苗的制備 (1)副溶血弧菌/7W和目的基因的克隆設(shè)計(jì)克隆基因的引物
上游5-GGATCCATGGCGATTAACGTT-3 (BamH I) 下游5-CTCGAGGCCCAACAAGCTTAg-3 (Xho I) 設(shè)計(jì)克隆基因的引物
上游5-CGGGATCCGCAGATTACTCTGACGGCGATAT-3 (BanH I) 下游5-CCCAAGCTTTTAGAACTTGTAAGTTACTGCGA-3 (Hind III) 以副溶血弧菌(標(biāo)準(zhǔn)株ATCC17802)總DNA為模板，分別采用設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行鞭毛蛋白 A基因片段和外膜蛋白K基因片段的PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳分析，可觀察到明顯的特異性條帶。采用flaA引物的PCR產(chǎn)物約1150bp，采用引物的PCR產(chǎn)物約730bp，電泳結(jié)果如圖1所示。分別將ompK和flaA的PCR產(chǎn)物用純化試劑盒純化后，連接pMD_19_T simple載體，構(gòu)建pMD-19T-o /l和pMD19T-/7d重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化至感受態(tài)五co7iDH5 α ,藍(lán)白篩選獲得陽(yáng)性重組菌。重組菌擴(kuò)大培養(yǎng)后，利用質(zhì)粒提取試劑盒提取重組質(zhì)粒。將pMD-19T_0mpK重組質(zhì)粒送上海生工進(jìn)行測(cè)序鑒定，測(cè)序結(jié)果表明基因大小為732bp。所測(cè)序列用blast搜索比對(duì)，與副溶血弧菌所報(bào)導(dǎo)ompK脅\ (GenBank登錄號(hào) D61392. 1)同源性達(dá)100%，表明所得到的PCR產(chǎn)物是目標(biāo)基因OmpK0將pMD-19T_FlaA重組質(zhì)粒送上海生工進(jìn)行測(cè)序鑒定，測(cè)序結(jié)果表明-MaA基因大小為lU8bp。所測(cè)序列用blast搜索比對(duì)，和已登錄的副溶血弧菌(RIMD2210633)鞭毛蛋白A (GenBank登錄NP798640. 1)基因的同源性高達(dá)99%，表明所得到的PCR產(chǎn)物是目的基因 flaA。(2)融合蛋白基因/7^-05 ^的構(gòu)建設(shè)計(jì)重疊延伸PCR引物
克隆融合片段基因的引物 FPA :5，-CGGGATCCATGGCGATTAACGTT -3，(BamH I) RPA :5’ -GCTACCGCCACCGCCGCCCAACAAGCTTAG -3’ 克隆融合片段基因的引物
FPK :5’ -GGCGGTGGCGGTAGCGCAGATTACTCTGACGGCGATAT- 3’ RPK :5’ -CCGCTCGAG TTAGAACTTGTAAGTTACTGCGA- 3’ (Xho I)采用設(shè)計(jì)的PCR引物，以上述獲得的/7M和片段為模板，實(shí)施重疊延伸PCR操作， 拼接擴(kuò)增得融合基因/Vd-o /^。延伸PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳分析，可觀察到目的片段，融合基因/Vd-Ofi4^片段的大小約為1800bp左右，與預(yù)計(jì)目的基因flaA-ompK (1875bp)相符合。分別將載體質(zhì)粒pET_28a (+)和融合基因flaA-ompK片段實(shí)施XhoI和BamHI雙酶切，T4DNA連接酶連接，構(gòu)建pET-28a-FlaA-0mpk重組質(zhì)粒。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌BL21，在含卡那霉素的LB培養(yǎng)基中經(jīng)藍(lán)白篩選獲得重組菌。擴(kuò)培重組菌，收集重組質(zhì)粒。將pET28a-FlaA-0mpK重組質(zhì)粒送上海生工進(jìn)行測(cè)序鑒定，測(cè)序結(jié)果表明融合基進(jìn)flaA-ompK大 、為187^ρ，其中/7W基因片段為112^ρ，基因片段為73^ρ，連接頭為15bp片段。將DNA測(cè)序結(jié)果用BLAST軟件搜索比對(duì)，結(jié)果如下融合基因flaA-ompK 的序列與預(yù)測(cè)的融合基因序列比對(duì)，相似度為100%。(3)重組蛋白Ompk、FlaA, FlaA-Ompk的表達(dá)與純化
將鑒定后的含重組表達(dá)載體的E. coli BL21，接種于含50 μ g/mL卡那霉素LB培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)至0D600約為0. 5-0. 8，加入IPTG至終濃度0. 5mmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)5h。4°C, 6000g離心收集菌體。將離心收集的菌體用適量預(yù)冷的PBS重懸，置冰浴中超聲波破碎。40C，6000g離心 20min,沉淀即為包涵體。根據(jù)Qiagen公司蛋白純化說(shuō)明書(shū)進(jìn)行重組蛋白純化。將純化產(chǎn)物置于透析袋，用TE 緩沖液(lOOmmolL-1，Tris-HCl (pH8. 0)，10mmol/L EDTA)透析，透析液每Mi換一次，透析6次。采用PEG20000進(jìn)行濃縮。重組蛋白FlaA-Ompk C端帶有6個(gè)His標(biāo)簽，可用Ni-NTA親和層析柱進(jìn)行分離純化。從圖2的SDS-PAGE電泳分析表明，純化后的重組蛋白FlaA-Ompk呈單一條帶，達(dá)到電泳純。在本專(zhuān)利中作為參照物的重組蛋白Ompk、FlaA同理制備，均達(dá)到電泳純。(4)重組蛋白FlaA-Ompk亞單位疫苗的制備抗原蛋白凍干后，4°C保存?zhèn)溆?。采用注射免疫方式時(shí)，將凍干的抗原蛋白FlaA-Ompk直接用生理鹽水溶解，即可進(jìn)行注射免疫。采用口服免疫方式時(shí)，需制備成口服腸溶微球疫苗。實(shí)施例2 FlaA-OmpK 口服腸溶微球疫苗的制備
稱(chēng)取IOOmg FlaA-QmpK蛋白，溶于20mL TE_buffer中，15g丙烯酸樹(shù)脂II號(hào)溶于250mL 乙醇中，這兩種溶液磁力攪拌混合均勻，作為內(nèi)油相。該內(nèi)油相于高速攪拌(彡10000r/min)下緩緩加入含IOOOmL含0. 5mL卵磷脂和 0. 35%Span80的液體石蠟中，乳化30min，后改為磁力攪拌(600r/min)，持續(xù)攪拌使乙醇完全揮發(fā)，微球固化。離心收集沉淀，石油醚洗滌數(shù)次，減壓干燥12h，即得最終產(chǎn)品。所制備腸溶微球，其載藥量為1%，包封率達(dá)77. 5%士3. 7%。電鏡觀察，粒子近球狀， 粒徑分布10-50nm, 粒徑10-30 nm的粒子占70%。按照魚(yú)的個(gè)體重量和攝食習(xí)慣，將所需劑量的口服腸溶疫苗微球與粉狀魚(yú)飼料按一定的比例混合，擠壓成型，即可直接投料喂養(yǎng)。實(shí)施例3 FlaA-OmpK亞單位疫苗對(duì)海水養(yǎng)殖黑石斑魚(yú)的免疫原性研究 3. 1 FlaA-OmpK亞單位疫苗對(duì)海水養(yǎng)殖黑石斑魚(yú)的免疫原性研究
6健康的美洲黑石斑魚(yú)(100士IOg/尾)隨機(jī)挑選分組，完全適應(yīng)養(yǎng)殖池環(huán)境后，進(jìn)行免疫試驗(yàn)。注射免疫方式，分為4個(gè)免疫組(OmpK組，融合蛋白FlaA-OmpK高劑量組，融合蛋白FlaA-OmpK低劑量組和混合蛋白組(OmpK +FlaA)，每組各25尾。上述實(shí)驗(yàn)組每尾魚(yú)給藥量(0. 2ml)分別為 OmpKClOOy g),FlaA-OmpK (230 μ g),FlaA-OmpK (100 μ g),0mpK+FlaA 等摩爾混合物(100 μ g)。OmpK組免疫時(shí)，藥物成分與弗氏完全佐劑(第一次免疫)/弗氏不完全佐劑(第二次免疫)按1:1混合，完全乳化后，腹腔注射。含F(xiàn)laA蛋白的免疫組，均不添加佐劑。對(duì)照組注射0.2mL無(wú)菌生理鹽水。首次免疫20天后，各組魚(yú)按首免劑量和方式加強(qiáng)免疫一次。首次免疫后每十天隨機(jī)挑選每組3尾石斑魚(yú)斷尾采血，分離血清，-200C 保存?zhèn)溆谩？诜庖叻绞剑瑢⑹唪~(yú)隨機(jī)分為二組，每組各25尾，分別投喂含有微球疫苗和未加疫苗的餌料。含有微球疫苗的自制餌料中重組蛋白含量為100yg/g餌料。第一次免疫，按0. 8g餌料/尾投喂石斑魚(yú)，即每次每只石斑魚(yú)免疫劑量為SOyg左右，連續(xù)投喂(自然攝食)3天。首次免疫后第20天加強(qiáng)免疫一次，口服免疫劑量與第一次免疫相同。與對(duì)照組相比，各重組蛋白免疫組均產(chǎn)生了顯著的特異性抗體效價(jià)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果 (表1)表明
(1)在相同給藥劑量(IOOyg/尾魚(yú))條件下，注射FlaA-OmpK組的抗體效價(jià)最高。 FlaA-OmpK組的抗OmpK抗體效價(jià)是FlaA+OmpK組的4倍，表明融合蛋白FlaA-OmpK的免疫原性顯著高于混合蛋白OmpK +FlaA。FlaA-OmpK組(不含佐劑)的抗OmpK抗體效價(jià)是 OmpK組(含有免疫增強(qiáng)佐劑)的2倍，表明融合蛋白FlaA-OmpK中的FlaA具有明顯的免疫增強(qiáng)作用。(2)在試驗(yàn)給藥的劑量范圍內(nèi)，注射FlaA-OmpK高劑量組和低劑量組的血清抗體效價(jià)沒(méi)有差異，表明在低劑量FlaA-OmpK (IOOyg/尾魚(yú))時(shí)已足以引起石斑魚(yú)的強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)。(3) 口服疫苗組的抗體效價(jià)在第30-40天達(dá)到最高值，明顯高于對(duì)照組，抗體效價(jià)達(dá)到1280，表明口服疫苗已誘發(fā)免疫反應(yīng)，盡管抗體效價(jià)低于注射組的抗體效價(jià)。表1 ELISA檢測(cè)第四十天魚(yú)血清抗體效價(jià)
3. 2 FlaA-OmpK免疫黑石斑魚(yú)抗血清對(duì)不同弧菌的交叉反應(yīng)性研究分別將副溶血弧菌(標(biāo)準(zhǔn)株、野生株)、哈維氏弧菌(標(biāo)準(zhǔn)株、野生株)、鰻弧菌(標(biāo)準(zhǔn)株、野生株)、溶藻弧菌(標(biāo)準(zhǔn)株、野生株)以及2株創(chuàng)傷弧菌包被96孔酶標(biāo)板，采用間接 ELISA測(cè)定黑石斑魚(yú)FlaA - OmpK抗血清對(duì)5種弧菌的交叉反應(yīng)性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，黑石斑魚(yú)FlaA - OmpK抗血清對(duì)于副溶血弧菌(標(biāo)準(zhǔn)株、野生株)、哈維氏弧菌(標(biāo)準(zhǔn)株、野生株)、溶藻弧菌(標(biāo)準(zhǔn)株、野生株)和鰻弧菌(標(biāo)準(zhǔn)株、野生株)均具有良好的交叉反應(yīng)性。實(shí)驗(yàn)稀釋度250-4000時(shí)，其P/N彡2. 1。創(chuàng)傷弧菌分為表面有莢膜型和表面無(wú)莢膜型。FlaA-OmpK免疫的黑石斑魚(yú)抗血清對(duì)表面無(wú)莢膜的創(chuàng)傷弧菌具有明顯的交叉反應(yīng)性，但對(duì)表面有莢膜的創(chuàng)傷弧菌反應(yīng)性較弱。創(chuàng)傷弧菌表面莢膜影響了抗血清中抗體與創(chuàng)傷弧菌外膜蛋白的接觸。表2 FlaA-OmpK免疫的黑石斑魚(yú)抗血清對(duì)不同弧菌的交叉反應(yīng)性(滴度)
實(shí)驗(yàn)菌株
反應(yīng)滴度
稀釋翻
副溶血弧菌
哈維氏弧菌
溶藻弧菌
111(
鰻弧菌
標(biāo)準(zhǔn)株(ATCCmo:) 野生株i+VpSP) 標(biāo)準(zhǔn)株ATCC E 野生株All-01) 標(biāo)準(zhǔn)株..AJCC 1 If^tti JS6051 標(biāo)準(zhǔn)株+ATCC ι 野生株 S狐5
創(chuàng)傷弧菌(帶莢膜HH 創(chuàng)傷弧菌(不帶芙膜".
50—4000 5C—40Μ. JC—4C0C
；η— Jirpr — Ar-.pr·.
J tJ — u Lr u
；η— j r."n 31J L·' υ· υ
5C— 4G0C 50—400C 30—40CC
實(shí)施例4 FlaA-OmpK亞單位疫苗對(duì)黑石斑魚(yú)預(yù)防副溶血弧菌(Vp89)感染的免疫保護(hù)
作用
攻擊病原菌為副溶血弧菌野生株(Vp89)，首先試驗(yàn)確定半致死量LD5(1。隨機(jī)將黑石斑魚(yú)(100士 IOg/尾)分成3組，每組10尾。Vp89活菌液按照梯度稀釋?zhuān)恐缓谑唪~(yú)腹腔注射0. 2mL菌液，觀察14天，記錄死亡的個(gè)數(shù)。測(cè)定Vp89的LD5tl為2. 53 X IO6,攻毒菌數(shù)采用 10 X LD5。，即 2. 53X 107。對(duì)照組的黑石斑魚(yú)人工感染后表現(xiàn)出典型的急性細(xì)菌出血性敗血病癥狀皮膚和鰭潰爛出血，腹部腫脹，眼球突出，鰓絲和腸道充血，少量腹水，肝臟腫大，具出血點(diǎn)，腸道充血發(fā)紅，膽囊萎縮，性腺發(fā)炎，后腎腫大，大多數(shù)在感染后2-4日內(nèi)死亡。從瀕死的魚(yú)體中分離病菌重新鑒定證明與用于人工感染的菌株相同。本實(shí)施例考察了 FlaA-OmpK亞單位疫苗在不同給藥方式時(shí)對(duì)副溶血弧菌感染的預(yù)防保護(hù)作用。免疫劑量與實(shí)施例3相同，即注射組，免疫劑量為IOOyg/尾魚(yú)，20天后再免疫第2次；口服微球疫苗組，平均每天每尾魚(yú)投喂餌料0. 8g，其中含腸溶微球疫苗80yg，自然攝食，連續(xù)3天投喂含腸溶微球疫苗的餌料，20天后再免疫第2次。
用融合蛋白FlaA-OmpK免疫過(guò)的黑石斑魚(yú)對(duì)于副溶血弧菌Vp89的攻擊均表現(xiàn)出較高的抵抗能力。FlaA-OmpK注射組對(duì)于10倍LD5tl劑量副溶血弧菌Vp89的攻擊，保護(hù)率仍高達(dá)80%; 口服FlaA - Ompk保護(hù)率為50%，雖然低于注射組，但也達(dá)到較理想的效果。本專(zhuān)利所提供的FlaA-OmpK亞單位疫苗，無(wú)論采用注射免疫方式或口服腸溶微球疫苗免疫方式，均能有效地發(fā)揮免疫保護(hù)作用，預(yù)防副溶血弧菌感染。表3 FlaA _ OmpK免疫的黑石斑魚(yú)對(duì)副溶血弧菌Vp89攻擊的免疫保護(hù)作用
實(shí)施例5 FlaA-OmpK亞單位疫苗對(duì)歐洲鰻鱺預(yù)防鰻弧菌(SMTO)感染的免疫交叉保護(hù)
作用
權(quán)利要求
1.一種魚(yú)類(lèi)廣譜弧菌亞單位疫苗，其特征在于所述疫苗以副溶血弧菌外膜蛋白OmpK 和鞭毛蛋白FlaA的融合蛋白FlaA-OmpK作為抗原成分。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的魚(yú)類(lèi)廣譜弧菌亞單位疫苗，其特征在于，抗原成分為FlaA和 OmpK通過(guò)連接肽Gly4Ser相連成重組融合蛋白FlaA-OmpK ；重組融合蛋白FlaA-OmpK的氨基酸序列如SEQ. NO. 1所示。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的魚(yú)類(lèi)廣譜弧菌亞單位疫苗，其特征在于，該疫苗用于防治副溶血弧菌、溶藻膠弧菌、哈維氏弧菌、鰻弧菌和創(chuàng)傷弧菌對(duì)魚(yú)類(lèi)的感染。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的魚(yú)類(lèi)廣譜弧菌亞單位疫苗，其特征在于所述疫苗的類(lèi)型為腹腔注射疫苗或口服腸溶微球疫苗，免疫方式為腹腔注射免疫或口服免疫。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的魚(yú)類(lèi)廣譜弧菌亞單位疫苗，其特征在于腹腔注射免疫時(shí)， 疫苗為重組融合蛋白FlaA-OmpK的生理鹽水溶液，免疫劑量為80-100 μ g/次，按IOOg體重計(jì)；口服免疫時(shí)，將口服腸溶微球疫苗摻合餌料中，自然攝食，免疫劑量為80-200 μ g/ 天，按IOOg體重計(jì)，連續(xù)2-4天口服免疫。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的魚(yú)類(lèi)廣譜弧菌亞單位疫苗，其特征在于所述口服腸溶微球疫苗，采用丙烯酸樹(shù)脂包裹融合蛋白FlaA-OmpK，使其具有腸溶功能，同時(shí)所制備的口服疫苗為微球狀，粒徑10 - 50nm。
7.根據(jù)權(quán)利要求4或6所述的魚(yú)類(lèi)廣譜弧菌亞單位疫苗，其特征在于所述口服腸溶微球疫苗的制備方法，包括如下步驟(1)融合蛋白FlaA-OmpKIOOmg溶于20mL TE_buffer中，10_30g丙烯酸樹(shù)脂II號(hào)溶于 250mL乙醇中，這兩種溶液在攪拌條件下混合均勻，作為內(nèi)油相；(2)內(nèi)油相在lOOOOr/min攪拌條件下緩慢加入IOOOmL液體石蠟，所述液體石蠟含 0. 1-1. OmL卵磷脂和0. 1-0.6% Span80，乳化30min后，改為常規(guī)攪拌600r/min，持續(xù)攪拌至乙醇完全揮發(fā)，微球固化；(3)離心收集微球顆粒，用乙醇洗滌數(shù)次，60°C干燥4h，即得口服腸溶微球疫苗。
8.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的魚(yú)類(lèi)廣譜弧菌亞單位疫苗，其特征在于所述融合蛋白 FlaA-OmpK的制備包括如下步驟(1)以副溶血弧菌的DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，分別獲得目標(biāo)基因/7W和(2)采用重疊延伸PCR技術(shù)，獲得融合蛋白基因flaA-ompK；(3)選用表達(dá)載體ρΕΤ48ει，構(gòu)建重組質(zhì)粒flaA-omPK—m-2^i；轉(zhuǎn)入感受態(tài)大腸桿菌BL21，篩選轉(zhuǎn)化子；在IPTG誘導(dǎo)下表達(dá)目標(biāo)蛋白；經(jīng)鎳柱親和層析法純化得到融合蛋白 FlaA-OmpK0
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種用于防治魚(yú)類(lèi)致病性弧菌感染的廣譜亞單位疫苗及其制備方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。該疫苗以副溶血弧菌表面具有保守結(jié)構(gòu)的外膜蛋白OmpK和鞭毛蛋白FlaA的融合蛋白OmpK-FlaA作為抗原成分。其特征是將副溶血弧菌的ompK和flaA基因通過(guò)重疊延伸PCR獲得融合蛋白基因flaA-ompK；構(gòu)建flaA-ompK－pET-28a重組質(zhì)粒，經(jīng)外源誘導(dǎo)表達(dá)并純化獲到高純度融合蛋白FlaA-OmpK。本發(fā)明制備的疫苗安全無(wú)毒副作用，可以采用注射免疫,也可以采用口服腸溶微球疫苗免疫，可針對(duì)魚(yú)類(lèi)致病性弧菌(副溶血弧菌、溶藻膠弧菌、哈維氏弧菌、鰻弧菌和創(chuàng)傷弧菌)產(chǎn)生交叉免疫保護(hù)作用。
文檔編號(hào)A61K39/106GK102512674SQ20111042708
公開(kāi)日2012年6月27日 申請(qǐng)日期2011年12月20日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月20日
發(fā)明者唐鳳翔, 林海英, 石賢愛(ài), 鄭允權(quán), 鄭磊, 郭養(yǎng)浩 申請(qǐng)人:福州大學(xué)