專利名稱：一種水母半胱氨酸蛋白酶抑制劑基因及其表達(dá)與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種新基因，特別是一種水母半胱氨酸蛋白酶抑制劑基因；本發(fā)明還涉及該基因的表達(dá)及其編碼的蛋白對(duì)木瓜蛋白酶的抑制作用。
背景技術(shù)：
蛋白酶抑制劑是對(duì)蛋白水解酶有抑制活性的一種水分子蛋白質(zhì)，普遍存在于植物、動(dòng)物和微生物中。在脊椎動(dòng)物體內(nèi)，蛋白酶抑制劑是免疫系統(tǒng)的組成部分，通過(guò)其活性中心與蛋白酶結(jié)合形成穩(wěn)定的復(fù)合體而起作用。無(wú)脊椎動(dòng)物中的蛋白酶抑制劑研究較少，值得注意的是，其體內(nèi)不存在免疫系統(tǒng)，所以蛋白酶抑制劑的作用更不容忽視。蛋白酶抑制劑是依據(jù)其作用的蛋白酶類型來(lái)分類的，主要分為抑制胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶等的絲氨酸蛋白酶抑制劑；對(duì)木瓜蛋白酶、無(wú)花果蛋白酶等起作用的半胱氨酸蛋白酶抑制劑；抑制胃蛋白酶等的羧基蛋白酶抑制劑和對(duì)膠原酶起作用的金屬蛋白酶抑制劑等。蛋白酶抑制劑作為新型藥物顯示出了廣闊的應(yīng)用前景，而且已在醫(yī)學(xué)上得到了應(yīng)用。
半胱氨酸蛋白酶抑制劑在多種有機(jī)體中具有不同的生理功能，主要保護(hù)組織和細(xì)胞免受由內(nèi)源和外源半胱氨酸蛋白酶引起的不必要的蛋白質(zhì)水解。在哺乳動(dòng)物體內(nèi)，半胱氨酸蛋白酶抑制劑參與多種病理反應(yīng)，如細(xì)胞凋亡、激素的合成和分解、病毒與細(xì)菌感染以及多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病，與長(zhǎng)期記憶、軸終端神經(jīng)阻斷、膜蛋白斷裂、細(xì)胞骨架改性及神經(jīng)肽新陳代謝等均直接相關(guān)。此外，半胱氨酸蛋白酶抑制劑還能抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。在農(nóng)作物病蟲(chóng)害的防治方面，半胱氨酸蛋白酶抑制劑通過(guò)破壞昆蟲(chóng)腸道內(nèi)的蛋白水解酶活性，明顯抑制昆蟲(chóng)的生長(zhǎng)發(fā)育，并能有效阻止病毒和寄生蟲(chóng)的入侵，在植物對(duì)害蟲(chóng)和病原體的侵染防御系統(tǒng)中有十分重要的作用。目前，半胱氨酸蛋白酶抑制劑已成為研究抗腫瘤、抗風(fēng)濕、抗菌、抗病毒、抗原蟲(chóng)等寄生蟲(chóng)感染以及治療多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病藥物的重要研究方向。
半胱氨酸蛋白酶抑制劑是單一鏈蛋白，至少由100～200個(gè)氨基酸殘基組成，存在與功能相關(guān)的保守序列基元。根據(jù)分子量大小、二硫鍵的數(shù)目、亞細(xì)胞定位和一級(jí)結(jié)構(gòu)的特征主要分為四種類型第一類Stefins包括Stefins A、B等，有大約100個(gè)氨基酸殘基組成，分子量約為11000道爾頓，沒(méi)有二硫鍵，也沒(méi)有信號(hào)肽；為胞內(nèi)蛋白。不含糖基化位點(diǎn)。
第二類Cystatin包括人類Cystatin C、D、S、SN和SA等，由120個(gè)左右的氨基酸殘基組成，分子量在13,000至14,000道爾頓之間，至少含有兩個(gè)特征性的二硫鍵，有信號(hào)肽，屬于分泌蛋白。不含糖基化位點(diǎn)。cystatinC在不同組織和體液中含量豐富，它是所有已知的cystatins中最有潛力的抑制劑。
第三類kininogens高分子量單鏈胞漿蛋白，N端有三個(gè)類似于cystatainC功能結(jié)構(gòu)域的糖基化位點(diǎn)，具有抑制活性。
在蛋白結(jié)構(gòu)方面，目前研究最多的是人的半胱氨酸蛋白酶抑制劑和雞的卵清蛋白酶抑制劑。研究發(fā)現(xiàn)，第一類和第二類蛋白酶抑制劑雖然在序列上存在差異，但是在二級(jí)結(jié)構(gòu)以及三級(jí)結(jié)構(gòu)上都有很大的相似性。分子的主體由五個(gè)反平行的β片層圍繞著中心的α螺旋所組成。不同的是第二類的抑制劑還存在另一個(gè)小的d螺旋但不參與酶的作用。
半胱氨酸蛋白酶抑制劑家族存在著三個(gè)非常保守的與酶起直接作用的區(qū)域，它們相互作用形成契形結(jié)構(gòu)插入酶的活性位點(diǎn)，與酶形成穩(wěn)定的復(fù)合物1、位于氨基端Gly-Aln殘基以及之前的肽鏈片斷。研究發(fā)現(xiàn)，以Aln起始的半胱氨酸蛋白酶抑制劑其活性比具有N端肽鏈的抑制劑活性降低10000倍。結(jié)構(gòu)分析表明，Gly之前的殘基是不規(guī)則排列的，自由延伸至溶液中，有利于酶的攻擊。而Gly的高度保守是由于維持分子活性結(jié)構(gòu)的需要。Gly-Aln殘基在抑制劑-酶復(fù)合體結(jié)構(gòu)中，與酶的活性位點(diǎn)非?？拷?br> 2、位于分子中央的QVVAG發(fā)卡環(huán)結(jié)構(gòu)。在三級(jí)結(jié)構(gòu)中，它與氨基端序列相毗鄰，具有高度疏水的側(cè)鏈，與酶的疏水側(cè)鏈發(fā)生相互作用。作用位點(diǎn)在酶活性位點(diǎn)以外。部分氨基酸的改變，對(duì)抑制劑活性的影響不大。
3、靠近C末端高度保守序列Pro-Trp。這兩個(gè)殘基具有高度的疏水側(cè)鏈，與酶發(fā)生直接的相互作用。
在特殊條件下，如高濃度、高溫、低pH值，以及特定位點(diǎn)的突變，能使半胱氨酸蛋白酶抑制劑形成寡聚體。該寡聚體仍保持與單體高度相似的二級(jí)結(jié)構(gòu)。
水母屬于腔腸動(dòng)物門(mén)，是較原始的多細(xì)胞動(dòng)物，身體由內(nèi)外兩胚層組成，具有組織分化及原始神經(jīng)系統(tǒng)。其特征是有許多觸手環(huán)繞于口周圍，有刺絲細(xì)胞(Nematocysts)，受到刺激后以刺絲射入其它生物體，釋放毒液而致中毒，往往引起嚴(yán)重的皮膚損傷，肌痙攣，肌無(wú)力，呼吸困難，肺水腫，血管充血，末梢血管收縮，意識(shí)喪失，甚至造成呼吸衰竭，心肌抑制而致死。水母的觸手和刺絲囊中存在大量毒性蛋白質(zhì)，通過(guò)蛋白質(zhì)的分離純化已從多種水母中提取出許多具有致死、溶血、心臟毒性、神經(jīng)毒性、肝細(xì)胞毒性、腎毒性或皮膚毒性的毒素蛋白。水母在傳統(tǒng)中藥中，有清熱解毒、軟堅(jiān)散結(jié)、降壓、抑菌、抗衰老的功效，可用于治療高血壓、氣管炎、哮喘、胃潰瘍、中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病等，并可作為神經(jīng)組織的活性物質(zhì)和組織胺釋放劑。
目前，國(guó)內(nèi)外尚無(wú)對(duì)水母半胱氨酸蛋白酶抑制劑的研究報(bào)道，對(duì)我國(guó)特有的水母資源進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)新的有應(yīng)用前景的水母半胱氨酸蛋白酶抑制劑，進(jìn)行基因重組、表達(dá)、定點(diǎn)突變、結(jié)構(gòu)和功能研究，具有很重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種新的水母半胱氨酸蛋白酶抑制劑基因；本發(fā)明的另一目的在于提供上述基因的表達(dá)；本發(fā)明的另一目的在于提供上述基因編碼的蛋白對(duì)木瓜蛋白酶的抑制作用。
本發(fā)明所選擇的水母為霞水母(Cyanea capillata)，采自廣西壯族自治區(qū)欽州港附近海域。
本發(fā)明構(gòu)建了霞水母觸手cDNA文庫(kù)首先分離水母觸手，提取總RNA，然后按Clontech公司SMARTTMcDNA LibraryConstruction Kit說(shuō)明書(shū)的操作進(jìn)行，獲得雙鏈cDNA，最后將雙鏈cDNA連接到改造的質(zhì)粒載體pcDNA3.0上并轉(zhuǎn)化E.coli，從而構(gòu)建成霞水母觸手的cDNA文庫(kù)。
本發(fā)明通過(guò)對(duì)霞水母觸手的cDNA文庫(kù)克隆的序列測(cè)定，從中得到了編碼霞水母半胱氨酸蛋白酶抑制劑的cDNA克隆，命名為Cystatin J。這個(gè)cDNA序列編碼131個(gè)氨基酸的前體蛋白，包括18個(gè)氨基酸的信號(hào)肽和113個(gè)氨基酸的成熟蛋白。成熟蛋白具有獨(dú)特的酶結(jié)合位點(diǎn)Ser97-Trp98，分子量為12,800道爾頓，目前，所有已報(bào)道的半胱氨酸蛋白酶抑制劑均具有高度保守的酶結(jié)合位點(diǎn)Pro-Trp，該位點(diǎn)具有高度的疏水側(cè)鏈，而由親水的Ser取代疏水的Pro，這在半胱氨酸蛋白酶抑制劑家族中尚屬首次報(bào)道；此外，這也是第一次在水母中發(fā)現(xiàn)半胱氨酸蛋白酶抑制劑。成熟蛋白具有第二類半胱氨酸蛋白酶抑制劑的典型特征。
本發(fā)明通過(guò)設(shè)計(jì)一對(duì)特異引物，將編碼霞水母半胱氨酸蛋白酶抑制劑成熟蛋白的核苷酸序列用PCR方法從pcDNA3.0載體上擴(kuò)增出來(lái)，克隆到原核融合表達(dá)載體pETTrx上，構(gòu)建成表達(dá)質(zhì)粒pETTrx-Cystatin J并將其轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)。經(jīng)過(guò)對(duì)培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)溫度、誘導(dǎo)時(shí)間等條件的摸索和優(yōu)化，融合蛋白的表達(dá)量占菌體總蛋白的30％以上，并且大部分以可溶形式存在。
本發(fā)明還摸索和優(yōu)化了重組Trx-Cystatin J蛋白的腸激酶酶切條件，通過(guò)對(duì)酶切時(shí)間、酶切溫度、酶終濃度等條件的摸索，可達(dá)到50％以上的酶切效率。
本發(fā)明還摸索和優(yōu)化了重組Cystatin J蛋白的純化條件，通過(guò)Ni2+螯合層析、腸激酶酶切和陽(yáng)離子交換層析，可得到純度達(dá)95％以上的重組Cystatin J蛋白。
本發(fā)明構(gòu)建了Cystatin J水母半胱氨酸蛋白酶抑制劑成熟蛋白編碼序列的表達(dá)質(zhì)粒pETTrx-Cystatin J，由該表達(dá)質(zhì)粒載體經(jīng)Kpn I/Not I雙酶切，可得到342bp的片段，即為水母半胱氨酸蛋白酶抑制劑Cystatin J成熟肽編碼序列。本發(fā)明的表達(dá)質(zhì)粒載體的復(fù)制方法參照Sambrook(Sambrook，et al.1989，Molecular cloing.Cold Spring HarborLabroratory Press.USA)方法，按CaCl2法在E.Coli.DH5α或BL21(DE3)菌株中轉(zhuǎn)化質(zhì)粒，用含氨芐青霉素(100μg/mL)的LB培養(yǎng)基轉(zhuǎn)化細(xì)菌，堿法提取質(zhì)粒。
本發(fā)明獲得的重組水母半胱氨酸蛋白酶抑制劑具有明顯的木瓜蛋白酶抑制活性。以競(jìng)爭(zhēng)性抑制的方式與蛋白酶形成1∶1的復(fù)合物，抑制常數(shù)Ki＜0.5nM。
本發(fā)明獲得的重組Cystatin J蛋白，在4℃條件下，抑制活性在pH4-11范圍內(nèi)均保持在80％以上，pH5～8之間活性最高；在中性pH值條件下，當(dāng)溫度高于50℃時(shí)，抑制活性呈下降趨勢(shì)。Arrhenius曲線顯示該重組蛋白的熱變性Ea值為5.14kcal/mol。


圖1為霞水母觸手總RNA電泳結(jié)果；圖2為霞水母觸手雙鏈cDNA電泳結(jié)果；圖3為霞水母觸手cDNA文庫(kù)總質(zhì)粒、PCR檢測(cè)和SfiI酶切電泳結(jié)果；圖4為霞水母觸手cDNA文庫(kù)重組子的PCR檢測(cè)電泳結(jié)果；圖5為含基因Cystatin J的重組質(zhì)粒pETTrx-Cystatin J表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建；圖6為霞水母Cystatin J基因的PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果；圖7為含基因Cystatin J的pETTrx-Cystatin J表達(dá)質(zhì)粒酶切和PCR鑒定電泳結(jié)果；圖8為重組Cystatin J蛋白表達(dá)的SDS-PAGE；圖9為重組Cystatin J蛋白純化的SDS-PAGE；圖10為重組Cystatin J蛋白對(duì)木瓜蛋白酶抑制作用的效價(jià)曲線；圖11為重組Cystatin J蛋白對(duì)木瓜蛋白酶的Dixon曲線；圖12為重組Cystatin J蛋白抑制活性的溫度穩(wěn)定性(一)；圖13為重組Cystatin J蛋白抑制活性的溫度穩(wěn)定性(二)；圖14為重組Cystatin J蛋白的Arrhenius曲線；圖15為重組Cystatin J蛋白抑制活性的pH值穩(wěn)定性；其中圖1中，M1 kb DNA ladder(Promega公司)；1霞水母觸手dsDNA；圖3中，M1 kb DNA ladder(Promega公司)；1文庫(kù)總質(zhì)粒的SfiI酶切結(jié)果；2文庫(kù)總質(zhì)粒的PCR結(jié)果；3文庫(kù)總質(zhì)粒；圖4中，M1 kb DNA ladder(Promega公司)；1-21文庫(kù)重組子的PCR檢測(cè)；圖6中，M1 kb DNA marker(NEB公司)；1霞水母CystatinJ基因的PCR產(chǎn)物；
圖7中，M1 kb DNA marker(NEB公司)；1pETTrx-CystatinJ的Kpn I/Not I雙酶切；2pETTrx-Cystatin J的PCR鑒定；圖8中，Mmarker；137℃總菌體；237℃超聲上清；337℃超聲沉淀；425℃總菌體；525℃超聲上清；625℃超聲沉淀；7含空載的總菌對(duì)照；圖9中，Mmarker；1重組Trx-cystatin J融合蛋白經(jīng)Ni2+螯合層析的500mM咪唑洗脫峰；2重組Trx-cystatin J融合蛋白腸激酶酶切產(chǎn)物；3酶切產(chǎn)物經(jīng)陽(yáng)離子交換層析的100mMNaCl洗脫峰；4酶切產(chǎn)物經(jīng)陽(yáng)離子交換層析的150mM NaCl洗脫峰。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明，將有助于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員進(jìn)一步理解本發(fā)明，但不以任何形式限制本發(fā)明。
實(shí)施例一 霞水母觸手cDNA文庫(kù)的構(gòu)建霞水母觸手總RNA的提取參照Gibcol BRL公司的TRIZOLLS試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行；cDNA的合成按Clontech公司SMARTTMcDNALibrary Construction Kit說(shuō)明書(shū)操作。
采用TRIZOLLS試劑提取的觸手總RNA經(jīng)1％甲醛變性膠電泳檢測(cè)可見(jiàn)如圖1的清晰的28S、18S兩條rRNA條帶，表明總RNA完整性良好。采用SMARTTMcDNA Library Construction Kit合成的cDNA在1％的瓊脂糖凝膠上電泳，結(jié)果呈現(xiàn)均勻的分布，如圖2所示，大小在200bp到5kb的范圍內(nèi)，主要集中在2kb以下的區(qū)域，表明cDNA的完整性良好。將cDNA插入質(zhì)粒載體pcDNA3上構(gòu)建成cDNA文庫(kù)，文庫(kù)克隆數(shù)為5.1×106。提取總文庫(kù)質(zhì)粒進(jìn)行酶切和PCR分析，如圖3所示，結(jié)果表明cDNA插入片段大小落在200bp-2kb的范圍內(nèi)，平均長(zhǎng)度為650bp。挑取454個(gè)克隆提取質(zhì)粒，酶切和PCR鑒定表明超過(guò)98％的克隆為重組子，如圖4所示，表明該cDNA表達(dá)文庫(kù)具有較好的質(zhì)量。
實(shí)施例二 霞水母觸手cDNA文庫(kù)的克隆、序列測(cè)定和分析挑選霞水母觸手cDNA文庫(kù)的克隆，按Vitagene 96-easyplasmid Mini-prep Kit的方法提取質(zhì)粒DNA。以T7通用引物為測(cè)序引物，采用自動(dòng)測(cè)序儀ABI Prism 3700 sequencer(Perkin-Elmer)對(duì)2153個(gè)隨機(jī)cDNA序列進(jìn)行了5’端測(cè)序。所得序列經(jīng)聚類、去除載體序列以及Blast X分析，結(jié)果表明霞水母觸手cDNA文庫(kù)包含的基因多種多樣，其中半胱氨酸蛋白酶抑制劑基因的豐度最高，有68個(gè)cDNA序列，命名為Cystatin J，水母半胱氨酸蛋白酶抑制劑基因編碼131個(gè)氨基酸的蛋白，如序列表所示，其中包括18個(gè)氨基酸殘基的信號(hào)肽和113個(gè)氨基酸殘基的成熟蛋白，成熟蛋白具有第二類半胱氨酸蛋白酶抑制劑的典型特征。成熟蛋白的分子量為12,800道爾頓，具有獨(dú)特的酶結(jié)合位點(diǎn)Set97-Trp98。
實(shí)施例三 重組霞水母半胱氨酸蛋白酶抑制劑表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建根據(jù)Cystatin J基因編碼的成熟蛋白兩端序列和原核融合表達(dá)載體pETTrx的多酶切位點(diǎn)，合成一對(duì)引物，序列如下上游引物，5’GCTGAA TTCGGT ACC CTACTT CCT GGC GGA ATA AGA CG 3’單下劃線部分為Kpn I酶切序列，雙下劃線為腸激酶酶切序列下游引物，5’CGTGCG GCC GC AGC TCG GAG GCA TTTTGI 3’單下劃線部分為Not I酶切序列，雙下劃線為終止密碼子PCR擴(kuò)增、基因克隆皆按常規(guī)方法進(jìn)行。PCR產(chǎn)物約450bp如圖6所示，編碼113個(gè)氨基酸殘基。將目的基因克隆到原核融合表達(dá)載體pETTrx上，構(gòu)建成表達(dá)質(zhì)粒pETTrx-Cystatin J。構(gòu)建的詳細(xì)過(guò)程見(jiàn)圖5。經(jīng)酶切鑒定和測(cè)序分析表明克隆的基因?yàn)槟康幕?，如圖7所示。
實(shí)施例四 重組霞水母半胱氨酸蛋白酶抑制劑的表達(dá)將表達(dá)質(zhì)粒pETTrx-Cystatin J轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)。含目的基因的工程菌在37℃劇烈振蕩培養(yǎng)至O.D.600＝0.6～0.8時(shí)，轉(zhuǎn)入25℃培養(yǎng)并加入終濃度為0.1mm的IPTG，誘導(dǎo)8小時(shí)。收集菌體，SDS-PAGE電泳分析表明，基因工程菌經(jīng)誘導(dǎo)后有明顯的特異表達(dá)產(chǎn)物帶，融合蛋白Trx-Cystatin J的分子量與預(yù)測(cè)值26kD相符，如圖8所示。在此條件下重組蛋白的表達(dá)量約占菌體總蛋白的30％以上，基本上處于可溶的狀態(tài)。
實(shí)施例五 重組霞水母半胱氨酸蛋白酶抑制劑的純化誘導(dǎo)后的菌體通過(guò)超聲破菌，離心取上清。超聲緩沖液為50mM Tris-HCl，pH 8.0，含100 mM NaCl。超聲上清經(jīng)過(guò)Ni2+螫合層析可獲得純度在90％以上的融合蛋白。在Ni2+螫合層析中用到的溶液有平衡緩沖液(50mM Tris-HCl，pH8.0，含100 mM NaCl.)、洗脫液1(50mM Tris-HCl，pH 7.0，含100mMNaCl.)、洗脫液2(50mM Tris-HCl，pH7.0，含100mM NaCl，150mM咪唑)和洗脫液3(50mM Tris-HCl，pH7.0，含100mMNaCl，500mM咪唑)。
洗脫后的融合蛋白用腸激酶在4℃條件下酶切4小時(shí)。酶切緩沖液為50mM Tris-HCl，pH7.5，含100mM NaCl。
酶切產(chǎn)物通過(guò)陽(yáng)離子交換層析可獲得純度在95％以上的重組蛋白，如圖9所示。在陽(yáng)離子交換層析中用到的溶液有平衡緩沖液(50mM PB，pH6.3)、洗脫液1(50mM PB，pH7.0，含100mM NaCl)、洗脫液2(50mM PB，pH7.0，含150mM NaCl)。
實(shí)施例六 重組霞水母半胱氨酸蛋白酶抑制劑效價(jià)的測(cè)定將木瓜蛋白酶與不同摩爾比的重組水母半胱氨酸蛋白酶抑制劑在反應(yīng)緩沖液中作用10分鐘。反應(yīng)緩沖液為20mM PB，pH6.2，含0.5mM EDTA，0.06mM β巰基乙醇and 2mM半胱氨酸。然后加入pH6.2，含1M NaCl，0.4mM EDTA和2mM半胱氨酸的BAEE溶液。具有活性的木瓜蛋白酶能水解BAEE產(chǎn)生酸，因此可以根據(jù)加入BAEE溶液后的產(chǎn)酸量來(lái)計(jì)算木瓜蛋白酶與抑制劑作用后的剩余活性。結(jié)果表明，隨著重組水母半胱氨酸蛋白酶抑制劑的增多，木瓜蛋白酶的活性明顯下降，當(dāng)二者摩爾比達(dá)到1∶1時(shí)，木瓜蛋白酶完全失活，如圖10所示。
實(shí)施例七 重組霞水母半胱氨酸蛋白酶抑制劑對(duì)木瓜蛋白酶抑制常數(shù)Ki的測(cè)定在不同底物(BAEE)濃度下，作出重組水母半胱氨酸蛋白酶抑制劑對(duì)木瓜蛋白酶的抑制曲線——Dixon曲線，如圖11所示。該曲線表明，該重組蛋白是以與底物競(jìng)爭(zhēng)的方式抑制木瓜蛋白酶的活性，根據(jù)曲線的交點(diǎn)坐標(biāo)可以得出重組抑制劑對(duì)木瓜蛋白酶的抑制常數(shù)Ki小于0.5nM。
實(shí)施例八 重組霞水母半胱氨酸蛋白酶抑制劑的溫度穩(wěn)定性將重組霞水母半胱氨酸蛋白酶抑制劑置于20～90℃溫浴10分鐘，然后立即冰浴，并測(cè)定其剩余的抑制活性。結(jié)果表明，重組蛋白的抑制活性在20～40℃均保持穩(wěn)定，當(dāng)溫度大于50℃時(shí)活性開(kāi)始下降，到90℃時(shí)活性下降到原始活性的27％，如圖12所示。
此外，將重組霞水母半胱氨酸蛋白酶抑制劑分別于4℃，30℃，60℃和90℃放置5分鐘至72小時(shí)，然后測(cè)定重組蛋白對(duì)木瓜蛋白酶的剩余抑制活性。結(jié)果表明，重組蛋白在4℃時(shí)非常穩(wěn)定，在30℃放置72小時(shí)后活性仍保持原始活性的82％，而在60℃和90℃活性下降較快，如圖13所示。計(jì)算重組霞水母半胱氨酸蛋白酶抑制劑的失活常數(shù)(Kinact)，4℃時(shí)為0；30℃時(shí)為4.17×10-5/min；60℃時(shí)為1.26×10-3/min；90℃時(shí)為1.52×10-2/min。Arrhenius曲線說(shuō)明了開(kāi)氏溫度與重組蛋白失活常數(shù)之間的關(guān)系，如圖14所示，由曲線可知，重組蛋白的活化能(Ea)為10.28kcal/mol。
實(shí)施例九 重組霞水母半胱氨酸蛋白酶抑制劑的pH穩(wěn)定性將重組霞水母半胱氨酸蛋白酶抑制劑置于4℃，分別在pH3～13條件下放置24小時(shí)，然后用200mM PB緩沖液將pH調(diào)至6.2，測(cè)定重組蛋白對(duì)木瓜蛋白酶的剩余抑制活性。結(jié)果表明，重組蛋白在pH5～8之間具有良好的穩(wěn)定性；在pH4以及pH9～11條件下，抑制活性仍保持原始活性的80％以上；而當(dāng)pH小于3或pH大于13時(shí)，抑制活性明顯降低，如圖15所示。
序列表<110>中山大學(xué)<120>一種水母半胱氨酸蛋白酶抑制劑基因及其表達(dá)與應(yīng)用<140><141><160>2<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>575<212>DNA<213>霞水母(Cyanea capillata sp)<220><221>CDS<222>(60)..(455)<220><221>sig_peptide<222>(60)..(113)<220><221>mat_peptide<222>(114)..(455)<220><221>polyA_site<222>(545)..(575)<400>1ggactatcta cttgtatcaa gcttctagtg gaactaccag gaagacatca acttacaaa 59atg cat ctt tat ctt tgt gtc ctt gta tgc ctg tcc att ggc atg gca 107Met His Leu Tyr Leu Cys Val Leu Val Cys Leu Ser Ile Gly Met Ala-15 -10 -5aat tgt cta ctt cct ggc gga ata aga cga atg aca gac gaa gaa ata 155Asn Cys Leu Leu Pro Gly Gly Ile Arg Arg Met Thr Asp Glu Glu Ile-1 1 5 10cag aat gat gaa att ctt ctc act ggt gtt gaa ttt gct gtt gat aaa 203Gln Asn Asp Glu Ile Leu Leu Thr Gly Val Glu Phe Ala Val Asp Lys15 20 25 30tac aac agt gac aca aat tca aga ctg att gca acg aat gtc att agt 251Tyr Asn Ser Asp Thr Asn Ser Arg Leu Ile Ala Thr Asn Val Ile Ser35 40 45gca acc gtt caa gtt gtt gct gga ttc aag tac aat gct ctc att gaa 299Ala Thr Val Gln Val Val Ala Gly Phe Lys Tyr Asn Ala Leu Ile Glu50 55 60tta cgt cct cgt ctt tgc gta caa gat cca aaa acg aag atc gct act 347Leu Arg Pro Arg Leu Cys Val Gln Asp Pro Lys Thr Lys Ile Ala Thr65 70 75tgt cca cta aga atg aat tta cca aca aaa tgc tca ttt acg ttc ctc 395Cys Pro Leu Arg Met Asn Leu Pro Thr Lys Cys Ser Phe Thr Phe Leu80 85 90tac cag tca tgg gta ccg caa aag tat tca atg ttg agc aca aaa tgc 443Tyr Gln Ser Trp Val Pro Gln Lys Tyr Ser Met Leu Ser Thr Lys Cys95 100 105 110ctc cga gct tga acaataattt tatcatattc tattttaatg taaagcataa 495Leu Arg Alagcttaataat atgatggtct gttgctttaa tcgaaaaata gacaaacaca taaaaaaaaa 555aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 575<210>2<211>131<212>PRT<213>霞水母(Cyanea capillata sp)<400>2Met His Leu Tyr Leu Cys Val Leu Val Cys Leu Ser Ile Gly Met Ala1 5 10 15Asn Cys Leu Leu Pro Gly Gly Ile Arg Arg Met Thr Asp Glu Glu Ile20 25 30Gln Asn Asp Glu Ile Leu Leu Thr Gly Val Glu Phe Ala Val Asp Lys35 40 45Tyr Asn Ser Asp Thr Asn Ser Arg Leu Ile Ala Thr Asn Val Ile Ser50 55 60Ala Thr Val Gln Val Val Ala Gly Phe Lys Tyr Asn Ala Leu Ile Glu65 70 75 80Leu Arg Pro Arg Leu Cys Val Gln Asp Pro Lys Thr Lys Ile Ala Thr85 90 95Cys Pro Leu Arg Met Asn Leu Pro Thr Lys Cys Ser Phe Thr Phe Leu
100 105 110Tyr Gln Ser Trp Val Pro Gln Lys Tyr Ser Met Leu Ser Thr Lys Cys115 120 125Leu Arg Ala130
權(quán)利要求
1.一種水母半胱氨酸蛋白酶抑制劑基因，核苷酸序列如序列表所示。
2.權(quán)利要求1所述基因編碼的蛋白，其特征在于該蛋白具有獨(dú)特的酶結(jié)合位點(diǎn)Ser97-Trp98，分子量為12,800道爾頓。
3.一種表達(dá)質(zhì)粒載體，其特征在于是由權(quán)利要求1所述的基因與原核融合表達(dá)載體pETTrx構(gòu)建而成。
4.權(quán)利要求2所述的蛋白在制備蛋白酶水解抑制劑中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種新的水母半胱氨酸蛋白酶抑制劑基因，以及該基因的表達(dá)及其在抑制蛋白酶水解中的應(yīng)用；本發(fā)明的基因所編碼的蛋白為131個(gè)氨基酸組成的前體蛋白，包括18個(gè)氨基酸的信號(hào)肽和113個(gè)氨基酸的成熟蛋白，其中成熟蛋白的分子量為12,800道爾頓；該成熟蛋白具有其獨(dú)特的酶結(jié)合位點(diǎn)Ser
文檔編號(hào)A61K38/57GK1451747SQ0312656
公開(kāi)日2003年10月29日 申請(qǐng)日期2003年5月15日 優(yōu)先權(quán)日2003年5月15日
發(fā)明者徐安龍, 楊彥臻, 彭立勝, 于萃玲, 衛(wèi)劍文, 楊文利 申請(qǐng)人:中山大學(xué)