專利名稱：一種組織工程化房室結及其構建方法與應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物醫(yī)學工程技術領域，具體涉及一種用于治療心臟房室傳導阻滯疾病的組織工程化房室結及其制備方法。
背景技術：
目前生物起搏治療房室傳導阻滯的思路是利用基因轉染或細胞移植的方法在傳導阻滯部位以下(如室間隔或左右心室壁)建立一個新的穩(wěn)定起搏點，提供并提高心室自主節(jié)律，或將起搏基因、起搏細胞導入傳導阻滯部位，修復病損的傳導組織，從而使患者避免接受電子心臟起搏器的植入，達到生物心臟起搏所倡導的理想治療狀態(tài)。然而，轉染起搏類基因雖然提高和產生了心肌細胞的自律性，初步證明可以創(chuàng)建異位起搏點，但依然面臨巨大的挑戰(zhàn)，如外源基因在體內缺乏長期穩(wěn)定的表達并且難以有效的調控；不能得到高效、安全、導向性好的載體系統(tǒng)等。利用細胞移植的方法創(chuàng)建新的起博點，理論上可以克服上述基因導入的局限性，該方法是將具有較高起博活性的外源細胞移植到心室，使其與宿主心肌細胞之間形成電機械耦聯(lián)，從而可以作為一個發(fā)放沖動的有效起搏點驅動心室收縮，達到治療目的。然而該種細胞由于移植到心臟后微環(huán)境適應能力差以及取材來源問題，來 艮難應用至Ij臨床治療。Potapova 等(Irina Potapova, et a 1. Human Mesenchymal Stem Cells as a Gene Delivery System to Create Cardiac Pacemakers. Circulation Research. 2004 ；94 :952.)將起搏基因修飾的間充質干細胞移植到竇停模型動物心室中， 但移植的細胞極易在心臟內遷移、彌散，不能形成穩(wěn)定統(tǒng)一的心臟節(jié)律或傳導通路。特別是，導入基因和細胞在心室創(chuàng)建新的起搏點、力圖提高心室自主節(jié)律治療房室傳導阻滯的思路，和安置電子起搏器一樣，畢竟只是對傳導阻滯所產生癥狀的一個緩解治療，對心臟功能的全面改善和疾患的徹底治愈作用有限。針對上述基因轉染和細胞移植治療房室傳導阻滯存在的問題和面臨的困難，并綜合考慮生物起搏治療研究的現(xiàn)狀，體外構建組織工程化的房室結，將之移植到心臟中修復或再建心臟傳導通路，應為房室傳導阻滯治療課題的理想解決方案。目前國內、外尚無構建組織工程化房室結的研究報道，僅有個例報道關于利用工程化組織構建物建立房室傳導通路的研究。Choi等(Choi YH, et al. 2006，Cardiac conduction through engineered tissue. Am J Pathol. 2006 ； 169(1) :72-85.)利用骨豁肌細胞和matrigel (水凝膠)在體外構建了一個組織體，并將之移植到大鼠心臟冠狀溝心外膜下，對再建房室傳導通路做了初步的嘗試。結果表明該構建物可以和周圍宿主心肌建立電機械耦聯(lián)，并且允許房室之間有電沖動傳導，初步證明了利用組織工程化組織再建房室傳導通路的可行性。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于提供一種組織工程化房室結及其構建方法與應用。本發(fā)明人設想，利用起搏細胞和傳導細胞作為種子細胞，以膠原海綿為支架材料，體外構建組織工程化的房室結，將之移植到心臟中修復或再建心臟傳導通路，應為房室傳導阻滯治療課題的理想解決方案。房室傳導阻滯的位點一般發(fā)生在房室間隔內的傳導路徑上，大體位置約在Koch三角的區(qū)域，包括房室結以及與之相連的房結區(qū)和結束區(qū)。理論上， 將組織工程化房室結移植到房室交界處的心外膜下，即將組織工程化房室結連接到心臟冠狀溝兩側房室心肌中，可越過阻滯位點并溝通其兩端的傳導，達到對房室阻滯的治療目的。本發(fā)明的技術方案是利用膠原海綿和骨髓間充質干細胞分別誘導獲得的心臟起搏細胞和傳導細胞，構建組織工程化房室結。本發(fā)明的關鍵在于如何采用骨髓間充質干細胞分別誘導獲得的心臟起搏細胞和傳導細胞作為種子細胞，膠原海綿作為支架，在體外構建具有起搏特性和心電傳導特性的組織工程化房室結，為治療心臟房室傳導阻滯疾病提供移植體。膠原海綿是一種可降解的生物支架材料，在體外培養(yǎng)條件下隨著培養(yǎng)環(huán)境的改變和時間的推移會逐漸的萎縮和降解。且種子細胞在其上的生長是否良好亦受種植的時間、濃度、方式的影響。因此，控制種子細胞種植的時間、濃度、方式以及支架材料的大小、形狀等，是利用膠原海綿和心臟起搏細胞和傳導細胞構建組織工程房室結的關鍵。本發(fā)明提供了一種組織工程化房室結的構建方法，具體技術方案如下A、與竇房結細胞共培養(yǎng)誘導骨髓間充質干細胞成為起搏細胞抽取骨髓接種培養(yǎng)獲得骨髓間充質干細胞，取竇房結組織進行原代培養(yǎng)獲得竇房結細胞。然后利用細胞培養(yǎng)池(Transwell)將竇房結細胞與骨髓間充質干細胞共培養(yǎng)，并且在培養(yǎng)液中添加lOmmol/L的5-氮雜胞苷結合10_8M的內皮素_1，培養(yǎng)時間6_7天，誘導骨髓間充質干細胞為心臟起搏細胞。通過倒置相差顯微鏡和透射電鏡觀察搏動情況以及形態(tài)、超微結構特征；利用免疫細胞化學檢測誘導前后細胞HCN2、HCN4、CX30. 2、CX40、CX43、CX45的表達；以及全細胞膜片鉗技術檢測細胞的膜電流情況，記錄動作電位等方法進行心臟起搏細胞鑒定。B、與心耳肌細胞共培養(yǎng)誘導骨髓間充質干細胞成為心臟傳導細胞抽取骨髓接種培養(yǎng)獲得骨髓間充質干細胞，取心耳部位組織進行原代培養(yǎng)獲得心耳肌細胞。然后利用細胞培養(yǎng)池(Transwell)將心耳肌細胞與骨髓間充質干細胞共培養(yǎng)， 并且施加旁分泌因子內皮素-1和神經調節(jié)蛋白-1 (濃度范圍1 X IO-8M-L 5X 10_8M)，培養(yǎng)時間6-7天，誘導骨髓間充質干細胞成為心臟傳導細胞。通過對縫隙鏈接蛋白40、HCN2等標記物的檢測進行心臟傳導細胞鑒定。C、利用膠原海綿和誘導獲得的心臟起搏細胞和傳導細胞構建組織工程化房室結將誘導成功的心臟起搏細胞和傳導細胞按一定的比例(1 1 1 2)制備成混合細胞懸液(混合細胞懸液的濃度范圍IX IO6個/ml-1. 2 X IO6個/ml)，采用沉淀法(參見《組織工程學教程》，人民軍醫(yī)出版社，2001版。將細胞懸液滴到支架材料上，不使其溢出為準)種植該混合細胞到膠原海綿支架上(種植密度3X105個/cm3-6X105個/cm3)，定期更換培養(yǎng)液在體外條件下培養(yǎng)15天，直到細胞支架復合體形成有功能的房室結，體外電刺激檢測傳導速率。上述的組織工程化房室結的構建方法中，竇房結細胞、心耳肌細胞、骨髓間充質干細胞可以選自犬、大鼠、兔子、小鼠等。上述的組織工程化房室結的構建方法中，膠原海綿由無錫貝迪生物有限公司提{共。上述的組織工程化房室結的構建方法中，步驟C具體為將膠原海綿剪成1. 5X 1. 0X0. 2cm大小，用鈷6°照射12小時以上消毒備用；分別取誘導獲得的心臟起搏細胞和傳導細胞，加0. 25%胰酶(Gibco公司)1ml， 于37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘，倒置相差顯微鏡下觀察，細胞胞體回縮呈圓形，加含10% FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基(Gibco公司)Iml終止消化，用玻璃滴管吹打成單細胞懸液，1200轉低速離心5分鐘，棄去上清液，加入含血清的培養(yǎng)液，用玻璃滴管吹打成單細胞懸液，調整細胞密度為IXlO6個/ml，將兩種細胞按一定的比例(1 1 1 2)混合制成混合細胞懸液，置4°C冰箱保存?zhèn)溆茫挥?孔培養(yǎng)板底滴加50 μ 1的細胞懸液，將膠原海綿置于細胞懸液中，待海綿將細胞懸液吸收后再向海綿表面滴加50μ 1的細胞懸液，置于37°C，含5% CO2的培養(yǎng)箱中孵育 1小時，再向培養(yǎng)孔中加入2ml含10% FBS的新鮮培養(yǎng)液，繼續(xù)置于37°C、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2周，每2天換一次液。本發(fā)明還提供了根據(jù)上述方法制備得到的組織工程化房室結。本發(fā)明還提供了上述組織工程化房室結在制備治療房室傳導阻滯疾病移植體中的應用。經動物實驗將構建成功的本發(fā)明組織工程化房室結移植治療房室傳導阻滯取得良好效果。通過移植手術，將構建成功的組織工程化房室結移植到心右纖維三角，顯微外科縫合，分別于兩周和一個月后給移植動物造成房室傳導阻滯，心電圖監(jiān)測組織工程化房室結改善房室傳導的情況。本發(fā)明獲取了一種具有起搏特性和心電傳導特性、可用于治療移植的組織工程化房室結，為治療心臟房室傳導阻滯所致心律失常疾病帶來了希望。
具體實施例方式現(xiàn)結合實施例，對本發(fā)明作詳細描述，但本發(fā)明的實施不僅限于此。實施例1 誘導犬骨髓間充質干細胞制備心起搏細胞和傳導細胞1.分離、培養(yǎng)犬骨髓間充質干細胞、犬竇房結細胞和犬心耳肌細胞(1)犬骨髓間充質干細胞的分離、培養(yǎng)犬全骨髓直接貼壁法培養(yǎng)骨髓間充質干細胞抽取成年雜交犬(第二軍醫(yī)大學實驗動物中心，15千克)髂骨骨髓10ml，900Xg離心lOmin，棄上清與脂肪；加入紅細胞裂解液TrisNH4Cl,40C 5min去除紅細胞，以IX 106/ml接種于纖粘連蛋白(FN) (Sigma公司) 包被的培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)基為60% DMEM-F12 (Gibco公司),10% FCS(Gibco公司)UOng/ml EGF(cytolab公司)UOOOU/ml LIF(Chemicon公司)。24h后去除懸浮未貼壁細胞，每3天換液1次，直到需要傳代。(2)新生犬竇房結細胞培養(yǎng)出生24h的犬心臟，在解剖顯微鏡下，于界嵴中部靜脈竇側、前腔靜脈根部取犬竇房結組織；剪成Imm大小的碎塊，在0. 07%的胰酶(Gibco公司)中4°C過夜消化。第一次的消化液棄去，再加入新鮮0. 07%的胰酶，37°C消化15分鐘，吸出消化液并中止消化，重復2 3次，直至全部組織塊消化完全。將消化液用200目的不銹鋼濾網過濾后，IOOOrpm離心 8min，加入含 20% FBS(Gibco 公司)的 DMEM-F12 培養(yǎng)基(Gibco 公司)，37°C 5% CO2 培養(yǎng)4小時，吸出含未貼壁細胞的培養(yǎng)液在6孔板中培養(yǎng)，調整細胞數(shù)至1 X 105/ml細胞，每孔接種2ml。培養(yǎng)48小時后換液。每孔加入2ml含0. lmmol/L BrdU和20% FBS的DMEM-F12
培養(yǎng)基。(3)犬心耳肌細胞的分離培養(yǎng)取新生犬心耳肌組織塊；剪成Imm大小的碎塊，在 0. 07%的胰酶(Gibco公司)中4°C過夜消化。第一次的消化液棄去，再加入新鮮0. 07%的胰酶，37°C消化15分鐘，吸出消化液并中止消化，重復2-3次，直至全部組織塊消化完全。將消化液用200目的不銹鋼濾網過濾后，IOOOrpm離心8min，加入含20% FBS (Gibco公司)的 DMEM-F12培養(yǎng)基(Gibco公司)，37°C 5% CO2培養(yǎng)4小時，吸出含未貼壁細胞的培養(yǎng)液在6 孔板中培養(yǎng)，調整細胞數(shù)至1 XlO5Ail，每孔接種anl。培養(yǎng)48小時后換液。每孔加入aiil 含0. lmmol/L BrdU(Sigma公司)禾口 20% FBS的DMEM-F12培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。2.骨髓間充質干細胞向心臟起搏細胞和傳導細胞方向的誘導分化(1)骨髓間充質干細胞向心臟起搏細胞方向的誘導分化及鑒定骨髓間充質干細胞加入Transwell小室，密度為每孔IX IO4個細胞。將種植細胞的Transwell小室插入生長竇房結細胞的6孔板中，在37°C 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。M小時后，施加IOmmol/L的5-氮雜胞苷(Sigma)結合1(Γ8Μ的內皮素_1 (Tocris)，連續(xù)培養(yǎng)7 天后進行誘導細胞的檢測鑒定。倒置相差顯微鏡可以觀察到單個細胞的搏動，細胞形態(tài)大部分為梭形和三角形。 免疫細胞化學檢測結果發(fā)現(xiàn)細胞HCN2、HCN4、CX30. 2、CX45 (Abeam公司)的表達陽性；全細胞膜片鉗技術檢測單個細胞的動作電位，顯示舒張末期有自動去極化，證明誘導后細胞為起搏細胞。(2)骨髓間充質干細胞向心臟傳導細胞方向的誘導分化及鑒定骨髓間充質干細胞加入Transwell小室，密度為每孔IX IO4個細胞。將種植細胞的"Transwell小室插入生長心耳肌細胞的6孔板中，在37°C 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。M小時后，向上述六孔板和Transwell小室加入旁分泌因子內皮素-I(Tocris)和神經調節(jié)蛋白-1 (RD公司)，使其終濃度為10_8M，連續(xù)培養(yǎng)7天后進行誘導細胞的檢測鑒定。倒置相差顯微鏡可以觀察到單個細胞的搏動，細胞形態(tài)大部分為梭形和三角形。 免疫細胞化學檢測誘導前后細胞縫隙連接蛋白40(CX40)和HCN2(Abcam公司)的表達，結果顯示CX40和HCN2的陽性表達明顯升高(ρ < 0. 05)，表明骨髓間充質干細胞已經向心臟傳導細胞方向轉化。全細胞膜片鉗技術檢測單個細胞的動作電位，顯示舒張末期有自動去極化，證明誘導后細胞為傳導細胞。實施例2 誘導獲得的犬心臟起搏細胞和傳導細胞種植到膠原海綿構建組織工程
化房室結1.組織工程化房室結的構建(1)膠原海綿準備膠原蛋白來源于牛跟腱的I型膠原，膠原海綿由無錫貝迪生物有限公司提供。將膠原海綿剪成1. 5X1. 0X0. 2cm大小，用鈷6(1照射12小時以上消毒備用。(2)犬心臟起搏細胞和傳導細胞混合液接種膠原海綿
分別取誘導獲得的心臟起搏細胞和傳導細胞，加0. 25%胰酶(Gibco公司)1ml，于 37°C,5% CO2培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘，倒置相差顯微鏡下觀察，細胞胞體回縮呈圓形，加含 10% FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基(Gibco公司)Iml終止消化，用玻璃滴管吹打成單細胞懸液， IOOOrpm離心5分鐘，棄去上清液，加入含血清的培養(yǎng)液，用玻璃滴管吹打成單細胞懸液，調整細胞密度為IXlO6個/ml，將兩種細胞按一定的比例(1 1 1 2)混合制成混合細胞懸液，置4°C冰箱保存?zhèn)溆?。?孔培養(yǎng)板底滴加50 μ 1的混合細胞懸液，將膠原海綿置于細胞懸液中，待海綿將細胞懸液吸收后再向海綿表面滴加50μ 1的混合細胞懸液，置于 37°C，含5% CO2的培養(yǎng)箱中孵育1小時，再向培養(yǎng)孔中加入2ml新鮮含10%胎牛血清的培養(yǎng)液，繼續(xù)置于37°C，含5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2周，每2天換一次液。2.組織工程化房室結的檢測鑒定(I)HE染色觀察心臟起搏細胞和傳導細胞在膠原海綿上的生長將上述生長2周的心臟起搏細胞、傳導細胞和膠原海綿復合體制備成石蠟切片進行HE染色，步驟如下蘇木素液染lOmin，自來水沖洗，75 %鹽酸乙醇溶液分化30s，水洗 lh，95%乙醇1 2min，伊紅復染1 2min，95%乙醇1 2min，脫水透明，中性樹膠封片。 通過HE染色觀察細胞膠原海綿復合體中種子細胞生長均勻、接觸緊密，心臟起搏細胞和傳導細胞與膠原海綿復合良好。(2)光學電位檢測儀(Optical mapping)和多導生理儀檢測細胞膠原海綿復合體的起搏特性和傳導速率使用光學電位檢測儀可檢測到膠原海綿復合體的起搏電位，多導生理儀檢測細胞膠原海綿復合體傳導速率，結果顯示電沖動的傳導速度為0. 014士0. OOlm/s，類似在體房室結區(qū)電位和傳導速率，證明所構建細胞膠原海綿復合體(組織工程化房室結)具有類似心臟房室結的特性。實施例3 組織工程化房室結移植體內觀察傳導效果通過開胸手術將上述構建成功的組織工程化傳導束移植到犬(第二軍醫(yī)大學實驗動物中心，15千克)房室交界處的心外膜下，即將組織工程化傳導束連接到心臟冠狀溝兩側房室心肌中，顯微外科縫合；移植前3天開始應用環(huán)孢素A (北京雙鷺藥業(yè)股份有限公司，劑量為0. 25mg/天)和潑尼松龍(上海通用藥業(yè)股份有限公司，劑量為0. Img/天)抑制免疫排斥反應。結果顯示本發(fā)明的組織工程房室結可以在宿主心肌中存活，移植組織中的細胞和宿主心肌細胞形成了電機械藕聯(lián)；移植一個月后給動物造房室傳導阻滯，心電圖(奧爾科特生物有限公司)監(jiān)測顯示組織工程化房室結可改善房室間傳導，證實所構建的組織工程化房室結具有再建心臟房室傳導通路的潛能。
權利要求
1.一種組織工程化房室結的構建方法，包括如下步驟A、與竇房結細胞共培養(yǎng)誘導骨髓間充質干細胞成為起搏細胞抽取骨髓接種培養(yǎng)獲得骨髓間充質干細胞，取竇房結組織進行原代培養(yǎng)獲得竇房結細胞，然后利用細胞培養(yǎng)池將竇房結細胞與骨髓間充質干細胞共培養(yǎng)，并且在培養(yǎng)液中添加 lOmmol/L的5-氮雜胞苷結合1(Γ8Μ的內皮素_1，培養(yǎng)時間6_7天，誘導骨髓間充質干細胞為心臟起搏細胞；B、與心耳肌細胞共培養(yǎng)誘導骨髓間充質干細胞成為心臟傳導細胞抽取骨髓接種培養(yǎng)獲得骨髓間充質干細胞，取心耳部位組織進行原代培養(yǎng)獲得心耳肌細胞，然后利用細胞培養(yǎng)池將心耳肌細胞與骨髓間充質干細胞共培養(yǎng)，并且施加旁分泌因子內皮素-1和神經調節(jié)蛋白-1，濃度均為1 X IO-8M-L 5 X 10 培養(yǎng)時間6_7天，誘導骨髓間充質干細胞成為心臟傳導細胞；C、利用膠原海綿和誘導獲得的心臟起搏細胞和傳導細胞構建組織工程化房室結將誘導成功的心臟起搏細胞和傳導細胞按1 1 1 2制備成混合細胞懸液，混合細胞懸液的濃度范圍1 X IO6個/ml-1. 2X IO6個/ml，采用沉淀法種植該混合細胞到膠原海綿支架上，種植密度為3 X IO5個/cm3-6 X IO5個/cm3，定期更換培養(yǎng)液在體外條件下培養(yǎng)15 天。
2.根據(jù)權利要求1所述的組織工程化房室結的構建方法，其特征在于其中所述的竇房結細胞、心耳肌細胞、骨髓間充質干細胞來源于犬、大鼠、兔子或小鼠。
3.根據(jù)權利要求1或2所述的組織工程化房室結的構建方法，其特征在于其中的步驟 C具體為將膠原海綿剪成1. 5 X 1. 0X0. 2cm大小，用鈷6°照射12小時以上消毒備用；分別取誘導獲得的心臟起搏細胞和傳導細胞，加0. 25%胰酶1ml，于37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘，倒置相差顯微鏡下觀察，細胞胞體回縮呈圓形，加含10% FBS的DMEM/ F12培養(yǎng)基Iml終止消化，用玻璃滴管吹打成單細胞懸液，1200轉低速離心5分鐘，棄去上清液，加入含血清的培養(yǎng)液，用玻璃滴管吹打成單細胞懸液，調整細胞密度為IX IO6個/ml， 將兩種細胞按1 1 1 2混合制成混合細胞懸液，置4°C冰箱保存?zhèn)溆?；?孔培養(yǎng)板底滴加50 μ 1的細胞懸液，將膠原海綿置于細胞懸液中，待海綿將細胞懸液吸收后再向海綿表面滴加50μ 1的細胞懸液，置于37°C，含5% CO2的培養(yǎng)箱中孵育1小時，再向培養(yǎng)孔中加入2ml含10% FBS的新鮮培養(yǎng)液，繼續(xù)置于37°C、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)兩周，每兩天換一次液。
4.根據(jù)權利要求1至3任一構建方法制備得到的組織工程化房室結。
5.一種如權利要求4所述的組織工程化房室結在制備治療房室傳導阻滯疾病移植體中的應用。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物醫(yī)學工程技術領域，目前國內、外尚無構建組織工程化房室結的研究報道。本發(fā)明提供了一種利用膠原海綿和骨髓間充質干細胞誘導獲得的心臟起搏細胞和傳導細胞構建組織工程化房室結的方法。本發(fā)明采用與竇房結細胞共培養(yǎng)誘導骨髓間充質干細胞成為起搏細胞，與心耳肌細胞共培養(yǎng)的方法誘導骨髓間充質干細胞成為心臟傳導細胞。將此兩種細胞作為種子細胞，膠原海綿作為支架，在體外構建具有起搏特性及心電傳導特性的組織工程化房室結。本發(fā)明經動物實驗將構建成功的組織工程化房室結移植治療房室傳導阻滯取得良好的治療效果。本發(fā)明獲取了一種具有心電傳導特性、可用于治療移植的組織工程化房室結，為治療心臟房室傳導阻滯所致心律失常疾病帶來了希望。
文檔編號A61L27/24GK102488923SQ201110415250
公開日2012年6月13日 申請日期2011年12月13日 優(yōu)先權日2011年12月13日
發(fā)明者劉鎮(zhèn), 姬瑞娟, 張傳森, 張喜, 張璐萍, 李玉泉, 楊向群, 郭金萍, 黃會龍 申請人:中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學