專利名稱：腦蛋白水解物溶液提取新方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其是一種腦蛋白水解物溶液的提取方法。
背景技術(shù)：
腦蛋白水解物注射液原液為淡黃色的澄明液體，為豬腦組織提取、分離、精制而得，內(nèi)含約16種游離氨基酸，并含少量肽；是一種大腦所特有的肽能神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)藥物，能以多種方式作用于中樞神經(jīng)，調(diào)節(jié)和改善神經(jīng)元的代謝，促進(jìn)突觸的形成，誘導(dǎo)神經(jīng)元的分化， 并進(jìn)一步保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞免受各種缺血和神經(jīng)毒素的損害。腦蛋白水解物注射液原液可通過血腦屏障，促進(jìn)腦內(nèi)蛋白質(zhì)的合成，影響呼吸鏈，具有抗缺氧的保護(hù)能力，改善腦內(nèi)能量代謝，激活腺苷酸環(huán)化酶和催化其它激素系統(tǒng)，提供神經(jīng)遞質(zhì)、肽類激素及輔酶前體。還可透過血腦屏障進(jìn)入神經(jīng)細(xì)胞，氨基酸在腦內(nèi)迅速代謝，T1/2由數(shù)秒至數(shù)小時(shí)。目前提取腦蛋白水解物注射液原液的方法一般有以下幾種1、多酶提取法是目前市場(chǎng)最常用的腦蛋白水解物溶液的提取方法，一般是先胃酶或胃蛋白酶水解，再使用胰酶或胰蛋白酶水解。該方法水解最大的缺點(diǎn)就是水解不徹底， 直接影響產(chǎn)品的氨基酸含量，所以后續(xù)生產(chǎn)過程中額外需添加氨基酸，以達(dá)到符合國(guó)家規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)。2、酶法+酸水解提取法該方法是建立在多酶提取法的基礎(chǔ)上，在繼續(xù)使用酸水解，一般采用6M鹽酸來(lái)水解，從而達(dá)到提高氨基酸含量的目的；但該方法最大的缺點(diǎn)在于， 酸水解會(huì)破壞產(chǎn)品中色氨酸，因此在產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中色氨酸含量不符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，同時(shí)該產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中的鑒別項(xiàng)也不符合規(guī)定。3、酶法+堿水解提取法該方法同樣是建立在多酶提取法的基礎(chǔ)上，再繼續(xù)使用堿水解，一般采用6M氫氧化鈉來(lái)水解，從而達(dá)到提高氨基酸含量的目的；但該方法最大的缺點(diǎn)在于，堿水解雖不會(huì)破壞產(chǎn)品中色氨酸，但產(chǎn)品中其余氨基酸的結(jié)構(gòu)會(huì)因?yàn)閴A水解而消旋，從而變成對(duì)人體無(wú)用的D型氨基酸。因此對(duì)產(chǎn)品的療效影響很大。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對(duì)技術(shù)不足，提出一種腦蛋白水解物溶液的提取方法，在提高氨基酸含量目的的同時(shí)，又保留了色氨酸，并且不改變氨基酸的結(jié)構(gòu)。為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案一種腦蛋白水解物溶液的提取方法，包括以下步驟①、取新鮮或冷凍豬腦，摘除小腦、腦干，并去除大腦腦組織表面的筋膜，用純化水或注射用水清洗干凈，加1 2倍純化水或注射用水膠體磨勻漿2 3次； ②、取步驟①的勻漿液，加熱至35 45°C，調(diào)節(jié)PH值7. 5 8. 5，加漿重0. 5 2. 5%的胰蛋白酶，攪拌反應(yīng)2 8小時(shí)；調(diào)節(jié)pH值至2. 0 2. 5，加熱至90°C以上，保溫 10 30分鐘，離心過濾；③、取步驟②離心上清液，按體積比1 3 1 3加入40 50wt%羥胺溶液，調(diào)節(jié)pH值至1. 5 2. 5，80 100°C密閉反應(yīng)10 30小時(shí)；冷卻至40°C以下，調(diào)節(jié)pH值至 6. 9 7. 5，離心過濾；④、取步驟③離心上清液，超濾，收集濾液。優(yōu)選 的，步驟④超濾所使用的是分子量為8KD 20KD的超濾膜。優(yōu)選的，步驟②胰蛋白酶的加入量為漿重的1%。優(yōu)選的，步驟③羥胺溶液的加入量與上清液的體積比為1 1。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明采用多酶水解結(jié)合羥胺裂解的方式來(lái)提取腦蛋白水解物溶液，該方法的原理在多酶提取法的基礎(chǔ)上，但后續(xù)采用了羥胺做裂解，在提高氨基酸含量目的的同時(shí)，又保留了色氨酸同時(shí)不改變氨基酸的結(jié)構(gòu)；利用羥胺能專一地裂解天冬酰胺和甘氨酸之間的肽鍵(Asn-Gly)。在酸性條件下裂解天冬酰胺和脯氨酸之間的肽鍵 (Asn-Pro) 0天冬酰胺和亮氨酸之間的肽鍵(Asn-Leu)與天冬酰胺和丙氨酸之間的肽鍵 (Asn-Ala)也能部分裂解。本發(fā)明提高了腦蛋白水解物注射液中氨基酸總量，以及提高了其中的肽含量，從而提高了該產(chǎn)品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，使之達(dá)到國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)。
具體實(shí)施例方式一種腦蛋白水解物溶液的提取方法，包括以下步驟步驟一取新鮮或冷凍豬腦，摘除小腦及腦干，并去除大腦腦組織表面的筋膜，用純化水或注射用水清洗干凈，加1 3倍純化水或注射用水膠體磨勻漿2 3次。步驟二 取勻漿液，加熱至35 45 °C，用氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值7. 5 8. 5，加漿重
0.5 2. 5%的胰蛋白酶，攪拌反應(yīng)2 8小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后，用鹽酸調(diào)節(jié)pH值至2. 0 2. 5，加熱至90°C以上，保溫10 30分鐘，離心過濾取上清。步驟三取離心上清液，按體積比1 1加入50%羥胺溶液，用鹽酸調(diào)節(jié)pH值至
1.5 2. 5，80 100°C密閉反應(yīng)10 30小時(shí)，反應(yīng)結(jié)束后冷卻至40°C以下，用氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值至6. 9 7. 5，離心過濾取上清。步驟四取離心上清液，用分子量8KD 20KD的超濾膜超濾，收集濾液按腦蛋白水解物注射液國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)。下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)描述，本部分的描述僅是示范性和解釋性，不應(yīng)對(duì)本發(fā)明的保護(hù)范圍有任何的限制作用。實(shí)施例1一種腦蛋白水解物溶液的提取方法，包括以下步驟①、取新鮮或冷凍豬腦，摘除小腦及腦干，并去除大腦腦組織表面的筋膜，用純化水清洗干凈，加1倍純化水膠體磨勻漿3次。②、取勻漿液，加熱至45°C，用氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值7. 5，加漿重2. 5%的胰蛋白酶， 攪拌反應(yīng)2小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后，用鹽酸調(diào)節(jié)pH值至2. 5，加熱至95°C，保溫30分鐘，離心過濾取上清。③、取離心上清液，按體積比1 1加入50襯％羥胺溶液，用鹽酸調(diào)節(jié)？!1值至2.5， 80°C密閉反應(yīng)30小時(shí)，反應(yīng)結(jié)束后冷卻至30°C，用氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值至7. 5，離心過濾取上清。
④、取離心上清液，用分 子量20KD的超濾膜超濾，收集濾液；按腦蛋白水解物注射液國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)WSi-(X-OIS)-ZOOIZ進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見下表1。實(shí)施例2一種腦蛋白水解物溶液的提取方法，包括以下步驟①、取新鮮或冷凍豬腦，摘除小腦、腦干，并去除大腦腦組織表面的筋膜，用注射用水清洗干凈，加2倍純化水或注射用水膠體磨勻漿2次；②、取勻漿液，加熱至35°C，調(diào)節(jié)pH值8. 5，加漿重0. 5%的胰蛋白酶，攪拌反應(yīng)8 小時(shí)；調(diào)節(jié)PH值至2. 5，加熱至940C，保溫10分鐘，離心過濾；③、取步驟②離心上清液，按體積比3 1加入40襯％羥胺溶液，調(diào)節(jié)？!1值至2.5， 90°C密閉反應(yīng)20小時(shí)；冷卻至33°C，調(diào)節(jié)pH值至7. 2，離心過濾；④、取步驟③離心上清液，用分子量8KD的超濾膜超濾，收集濾液；按腦蛋白水解物注射液國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)WSi-(X-OIS)-ZOOIZ進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見下表1。實(shí)施例3—種腦蛋白水解物溶液的提取方法，包括以下步驟①、取新鮮或冷凍豬腦，摘除小腦、腦干，并去除大腦腦組織表面的筋膜，用注射用水清洗干凈，加1. 5倍純化水或注射用水膠體磨勻漿3次；②、取勻漿液，加熱至40°C，調(diào)節(jié)pH值8. 0，加漿重1 %的胰蛋白酶，攪拌反應(yīng)5小時(shí)；調(diào)節(jié)PH值至2. 2，加熱至98°C，保溫20分鐘，離心過濾；③、取步驟②離心上清液，按體積比1 3加入45襯％羥胺溶液，調(diào)節(jié)pH值至2.0， 92 °C密閉反應(yīng)15小時(shí)；冷卻至37°C，調(diào)節(jié)pH值至6. 9，離心過濾；④、取步驟③離心上清液，用分子量12KD的超濾膜超濾，收集濾液；按腦蛋白水解物注射液國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)WSi-(X-OIS)-ZOOIZ進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見下表1。表1為各實(shí)施例產(chǎn)品的檢測(cè)情況
權(quán)利要求
1.一種腦蛋白水解物溶液的提取方法，包括以下步驟①、取新鮮或冷凍豬腦，摘除小腦、腦干，并去除大腦腦組織表面的筋膜，用純化水或注射用水清洗干凈，加1 2倍純化水或注射用水膠體磨勻漿2 3次；②、取步驟①的勻漿液，加熱至35 45°C，調(diào)節(jié)pH值7.5 8. 5，加漿重0. 5 2. 5% 的胰蛋白酶，攪拌反應(yīng)2 8小時(shí)；調(diào)節(jié)pH值至2. 0 2. 5，加熱至90°C以上，保溫10 30 分鐘，離心過濾；③、取步驟②離心上清液，按體積比1 3 1 3加入40 50襯％羥胺溶液，調(diào)節(jié)pH 值至1. 5 2. 5，80 100°C密閉反應(yīng)10 30小時(shí)；冷卻至40°C以下，調(diào)節(jié)pH值至6. 9 7. 5，離心過濾；④、取步驟③離心上清液，超濾，收集濾液。
2.如權(quán)利要求1所述的提取方法，其特征在于步驟④超濾所使用的是分子量為 8KD 20KD的超濾膜。
3.如權(quán)利要求1所述的提取方法，其特征在于步驟②胰蛋白酶的加入量為漿重的1%。
4.如權(quán)利要求1所述的提取方法，其特征在于步驟③羥胺溶液的加入量與上清液的體積比為1:1。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種腦蛋白水解物溶液的提取方法，采用多酶水解結(jié)合羥胺裂解的方式來(lái)提取腦蛋白水解物溶液，在多酶提取法的基礎(chǔ)上，但后續(xù)采用了羥胺做裂解，在提高氨基酸含量目的的同時(shí)，又保留了色氨酸，并且不改變氨基酸的結(jié)構(gòu)；利用羥胺能專一地裂解天冬酰胺和甘氨酸之間的肽鍵；在酸性條件下裂解天冬酰胺和脯氨酸之間的肽鍵；天冬酰胺和亮氨酸之間的肽鍵與天冬酰胺和丙氨酸之間的肽鍵也能部分裂解。本發(fā)明提高了腦蛋白水解物注射液中氨基酸總量，以及提高了其中的肽含量，從而提高了該產(chǎn)品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，使之達(dá)到國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)。
文檔編號(hào)A61P25/28GK102302767SQ20111022733
公開日2012年1月4日 申請(qǐng)日期2011年8月9日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月9日
發(fā)明者劉保林, 周正兵, 高留根 申請(qǐng)人:杭州華津藥業(yè)股份有限公司