專利名稱：一種鮸魚α類趨化因子基因CXCL10、檢測(cè)方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及魚類免疫器官中表達(dá)的基因序列，更具體涉及一種從鯢魚脾臟和腎臟 SMART cDNA文庫(kù)中篩選出的一個(gè)新α類趨化因子基因CXCLlO的核苷酸序列、氨基酸序列及其時(shí)空表達(dá)圖譜。
背景技術(shù)：
動(dòng)物免疫包括先天性免疫和獲得性免疫兩種。先天性免疫是指生物體所具有的對(duì)病原體和有害異物的基本天生抵抗性和防御性。先天免疫對(duì)絕大多數(shù)的病原體和有害異物具有快速、有力和非特異性作用的特點(diǎn)，尤其是在應(yīng)對(duì)一些毒力發(fā)揮快，極易造成疫病暴發(fā)的病原體入侵中，能否對(duì)入侵病原體進(jìn)行有效的先天免疫往往是宿主動(dòng)物存活與否的關(guān)鍵。先天免疫包括從體表到體內(nèi)細(xì)胞及分子等不同層次的防御體系。體表屏障較易被病原體突破，且一旦突破后則經(jīng)常引起組織損傷，為其他潛在的病原體入侵提供有利途徑，此時(shí)在細(xì)胞及分子層次上以炎癥反應(yīng)為主的一系列復(fù)雜免疫反應(yīng)對(duì)殺滅入侵病原體具至關(guān)重要的作用。趨化因子大多是能結(jié)合肝素的多肽，主要由白細(xì)胞分泌，通過(guò)受體介導(dǎo)引起粒細(xì)胞、單核細(xì)胞及淋巴細(xì)胞的定向遷移和活化，對(duì)淋巴細(xì)胞再循環(huán)，炎癥反應(yīng)以及抗腫瘤等方面具有重要作用。依照保守的半胱氨酸殘基，可分為CXC ( α )，CC ( β )，C ( γ )和CX3C (S)四類。α類趨化因子是最早鑒定的具有趨化嗜中性粒細(xì)胞的趨化因子，同時(shí)其也具有趨化單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的功能。α類趨化因子專門吸引能表達(dá)CXCRl和CXCR2的嗜中性粒細(xì)胞。它們能在很廣泛的細(xì)胞中對(duì)許多刺激物作出反應(yīng)，特別是對(duì)像白細(xì)胞介素I和腫瘤壞死因子這樣的前炎癥細(xì)胞因子。主要的作用是促進(jìn)嗜中性粒細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的黏附以及隨后的相關(guān)基質(zhì)蛋白和細(xì)胞表面物質(zhì)沿著趨化因子的濃度梯度向炎癥灶的定向移動(dòng)并清除入侵病原體和有害異物。因此，對(duì)趨化因子基因超家族成員的克隆鑒定及其蛋白產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)和功能研究無(wú)疑能為魚類先天免疫分子機(jī)制解析及提高魚體抗病力提供堅(jiān)實(shí)的技術(shù)支撐。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在提供一種新的鯢魚α類趨化因子基因序列及對(duì)應(yīng)氨基酸序列、檢測(cè)方法和在制備鯢魚抵抗病原微生物入侵產(chǎn)品中的應(yīng)用。為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的發(fā)明目的，發(fā)明人提供如下技術(shù)方案
一種鯢魚α類趨化因子基因CXCL10，具有如SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列。一種鯢魚α類趨化因子基因CXCL10，它編碼的蛋白質(zhì)具有如SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列。本發(fā)明所述的基因CXCLlO是從鯢魚脾臟、腎臟的SMART cDNA質(zhì)粒文庫(kù)中篩選到的一個(gè)基因，其cDNA序列和編碼的蛋白質(zhì)序列如下。該基因cDNA全長(zhǎng)1157bp，自74bp 到442bp區(qū)段為其開(kāi)放閱讀框，編碼122個(gè)氨基酸，5’端非翻譯區(qū)長(zhǎng)73bp，3’端非翻譯區(qū)長(zhǎng)7Mbp，有1個(gè)mRNA半衰期信號(hào)，多聚腺苷酸加尾信號(hào)(AATAAA)及多聚腺苷酸尾巴。在 Genbmk中進(jìn)行同源性分析確定其為趨化因子基因超家族成員。CXCLlO基因的cDNA序列如下 ggggactacagatagtccagactgaagaaagactgagtgcactgtgatccagaacccgtctacagcaacaac
tATGAATTCAGCTGCTGTTGCCTTTCTCGTCTGCCTGCTTGTCTTCTATACACAAGGGCAACCAACCAACAGATCTA TTAAGTGTAAGTGTTTAAACGGTTATGTGGGCAAAATCAAACCACAAGACATCAAGGCAGGGCCTGTCACACATGAG CCAAGTATCTTCTGTCCACGTACAGAGATTATTATTACAACAACAGAAAATAGGGAGAAATGTGTGAATCCACGCTC ACCACTCGGAAAACTCATCCTGAAAAACAAAAACAAGTACCAGAAAAATGCAACTGTGAATACGACAGCAGCTTCAA GCTCAACGGACACGACAGCAGCTTCAAGCTCAACAAGACACCACACAACATCCAGGCTGTAGgactctgccactgca ctgaagaggatggagctgaaacactttttattgttgttgttcaccatcactgccttttatcaagtaaatacaataag tgggtagaagtgatcaaagtgtctgtttgtcctcttatatttgttgtggagaaattgctgaagtcagtggtcaatgg tgaggtcaggaaggaagaaagtgttcaggagcctctgatgtcttatgctgtatta^tttattgacgcttggccaagaa gaattagagacactctcaaagtacatcagaagtgcctgagtcggtctcacattctgccaaactcatcctggtggata gactttaaacccctacagataacaccacaaatactatacgcccagaattagccaaagagaatgtttttacccatgca ggtgttattctcagcatattctagtctggagacacagatgtctgtttacacagattggaacgtcaacggccagctat ctattatgtctatgaaggcagcaatagtctcttcgaccctggccaccacactgttgagatagactggcacctactgt tcccaatcaaagccaaacaattaatactgccgaggaccttaaggcccacacgtgaccttgtgtaagctaaggataaa aaattccataacaacattgtcttcatgtgtacataccaaataaatcatctgtatatactttttaagcaaaaaaaaaaCXCLlO基因編碼的蛋白質(zhì)序列如下 MNSAAVAFLVCLLVFYTQGQPTNRSIKCKCLNGYVGKIKPQDIKAGPVTHEPSIFCPRTEIIITTTENREKCV
NPRSPLGKLILKNKNKYQKNATVNTTAASSSTDTTAASSSTRHHTTSRL。本發(fā)明還提供了一種鯢魚α類趨化因子基因CXCLlO的檢測(cè)方法，其中，所述的檢測(cè)方法至少包括使用一對(duì)熒光定量PCR引物，所述的一對(duì)熒光定量PCR引物由上游引物和下游引物組成，其中，所述的上游引物(CXCL10-RT-F)具有如SEQ ID NO. 3所示的核苷酸序列；下游引物(CXCL10-RT-R)具有如SEQ ID NO. 4所示的核苷酸序列。本發(fā)明還提供了上述的一種鯢魚α類趨化因子基因CXCLlO在制備鯢魚抵抗病原微生物入侵產(chǎn)品中的應(yīng)用。作為優(yōu)選，根據(jù)本發(fā)明所述的一種鯢魚α類趨化因子基因CXCLlO在制備鯢魚抵抗病原微生物入侵產(chǎn)品中的應(yīng)用，其中，所述的病原微生物包括鰻弧菌。發(fā)明人運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)了 CXCLlO在鯢魚的鰾、眼球、鰭條、鰓、心臟、小腸、腎臟、肝臟、肌肉、脾臟中的轉(zhuǎn)錄本水平，結(jié)果表明該基因在所檢測(cè)的十個(gè)組織中均有mRNA轉(zhuǎn)錄本存在，其中在小腸中的豐度最高，其次在眼球中，而在其他組織中則只檢測(cè)到較少量的mRNA轉(zhuǎn)錄本存在。另外還檢測(cè)到經(jīng)鰻弧菌刺激后的脾臟和腎臟中的CXCLlO 基因表達(dá)量呈上升趨勢(shì)，明顯較正常水平高，這提示該基因在鯢魚抵抗病原微生物入侵中具有重要功能。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)
本發(fā)明的基因的獲得不僅為研究魚類趨化因子CXCLlO分子在先天免疫反應(yīng)中的作用機(jī)理奠定基礎(chǔ)，而且通過(guò)基因序列可以獲得具有生物活性的蛋白產(chǎn)物，為進(jìn)一步研究CXCLlO的免疫學(xué)功能提供理論基礎(chǔ)。此外，本發(fā)明的基因還可以用于抗病相關(guān)性研究。


圖1為熒光定量檢測(cè)基因CXCLlO在鯢魚組織中的表達(dá)。圖2-1、2_2和2-3是鯢魚經(jīng)鰻弧菌感染后肝臟、脾臟和腎臟組織中的CXCLlO基因表達(dá)的時(shí)空?qǐng)D譜，其中圖2-1代表肝臟；圖2-2代表脾臟；圖2-3代表腎臟。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例和說(shuō)明書附圖，更具體地說(shuō)明本發(fā)明的內(nèi)容。應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明的實(shí)施并不局限于下面的實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明所做的任何形式上的變通和/或改變都將落入本發(fā)明保護(hù)范圍。在本發(fā)明中，若非特指，所有的份、百分比均為重量單位，所有的設(shè)備和原料等均可從市場(chǎng)購(gòu)得或是本行業(yè)常用的。若無(wú)特別指明，實(shí)施例采用的方法為本領(lǐng)域通用技術(shù)。主要材料、試劑和儀器設(shè)備手術(shù)刀，眼科剪，鑷子，解剖盤，充氧泵，水箱，1.5ml 離心管，微量移液器、微量移液器槍頭，一次性培養(yǎng)皿，陶瓷研缽。脫氧核糖核苷酸dNTP， 熱聚合 Taq 酶，Trnzol-A+ 總 RNA 提取試劑盒，RealMasterMix(SYBRGreen)試劑，Quant cDNA第一鏈合成試劑盒以及DH5a感受態(tài)細(xì)胞，SMART cDNA Library Construction Kit,小型離心機(jī)(Qspin ，BAYGENE),渦旋振蕩器(QL-866型，QILINEBEIER),核酸蛋白儀 (SmartSpace Plus, Bio-feid)，超凈工作臺(tái)(SW — CJ一IG型，名牌之星)，恒溫培養(yǎng)箱(型號(hào)或生產(chǎn)商)，_80°超低溫冰箱(Thermo scientific)，熒光定量PCR系統(tǒng)(ABI 7300型)pH計(jì) (Mettler Toledo 320PH Meter)、高壓蒸氣滅菌鍋(SANYO)、高速冷凍離心機(jī)(Centrifuge 5417R, eppendorf)、電泳儀(DYY-6C型，北京六一)、水浴鍋(上海精宏)、凝膠成像系統(tǒng) (Bio-Rad GD2000)、PCR 儀(ABI Veriti 96well Thermal Cycler)、自動(dòng)測(cè)序儀(ABI 3730 型)。實(shí)驗(yàn)樣本鯢魚采集于浙江省海洋水產(chǎn)研究所。本發(fā)明實(shí)施例所用的常規(guī)藥品氯仿(分析純)，異丙醇(分析純)，氯霉素，氯化鈉(分析純)購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)，異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)，5-溴-4-氯-3-吲哚-β -D-半乳糖苷(X-gal)，胰蛋白胨，酵母提取物，瓊脂糖，溴化乙錠，焦碳酸二乙酯 (DEPC)等購(gòu)自Takara公司，液氮為浙江省舟山億洋氣體有限公司產(chǎn)品，脫氧核糖核苷酸 dNTP,熱聚合 Taq 酶，Trnzol-A+ 總 RNA提取試劑盒，RealMasterMix (SYBRGreen)試劑，Quant cDNA第一鏈合成試劑盒以及DH5a感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自TIANGEN公司，SMART cDNA Library Construction Kit購(gòu)自Clontech公司，質(zhì)粒文庫(kù)測(cè)序由華大基因公司完成，引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成；
本發(fā)明實(shí)施例所用主要儀器包括小型離心機(jī)(Qspin ，BAYGENE),渦旋振蕩器 (QL-866 型，QILINEBEIER),核酸蛋白儀(SmartSpace Plus, Bio-Rad),超凈工作臺(tái) (SW—CJ一IG型，名牌之星)，恒溫培養(yǎng)箱(型號(hào)或生產(chǎn)商)，-80°超低溫冰箱(Thermo scientific)，熒光定量 PCR 系統(tǒng)(ABI 7300 型)pH 計(jì)(Mettler Toledo 320PH Meter)、高壓蒸氣滅菌鍋(SANYO)、高速冷凍離心機(jī)(Centrifuge 5417R,印pendorf)、電泳儀(DYY-6C 型，北京六一)、水浴鍋(上海精宏)、凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad⑶2000)、PCR儀(ABI Veriti96well Thermal Cycler)、自動(dòng)測(cè)序儀(ABI 3730 型)。實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，是按照常規(guī)條件，例如Sambrook等作者的分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New York Co Id Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商說(shuō)明書建議的條件。實(shí)施例1
1.利用Trnzol-A+總RNA提取試劑盒(TIANGEN)提取鯢魚脾臟、腎臟總RNA 取健康的鯢魚(體重約750g)在充氧水箱養(yǎng)殖14日后，腹腔注射Iml的鰻弧菌 (1. 2X108 cfu/ml)。刺激24h后，解剖魚體取出脾臟和腎臟，液氮速凍后放入_80°C超低溫冰箱備用。分別取備用脾臟和腎臟組織約IOOmg用液氮研磨后加入Iml的Trnzol-A+總 RNA提取試劑(TIANGEN)勻漿，按照試劑盒說(shuō)明提取總RNA。將兩個(gè)組織所得的總RNA合并于一個(gè)1. 5ml的離心管中，取2μ 1分別用核酸蛋白儀和電泳檢測(cè)總RNA濃度和質(zhì)量。2. SMART cDNA 文庫(kù)構(gòu)建
SMART cDNA 的合成步驟詳見(jiàn) SMART cDNA Library Construction Kit 試劑盒操作手冊(cè)。取鯢魚脾腎組織mRNA lug，按試劑盒用戶手冊(cè)所提供的文庫(kù)構(gòu)建方法合成第一鏈 cDNA 加入3，-CDS引物和SMART II寡核苷酸各1 μ 1，72°C孵育^iiin后，冰上急冷2min， 然后在終體積為10 μ 1的反應(yīng)體系中，加入5Χ第一鏈反應(yīng)緩沖液(250mmol/L Tris-Hcl, PH8.3; 375mmol/L Kcl ； 30mmol/L MgC12)2μ 1，DTT (20mmol/L)1 μ 1，dNTP (lOmmol/L) 1 μ 1和Powerscript逆轉(zhuǎn)錄酶1 μ 1，42°C保溫Ih合成第一鏈cDNA。取2 μ 1第一鏈cDNA 加入 dNTP 2 μ 1, SMART cDNA Library Construction Kit 試劑盒中對(duì)應(yīng)的 PCR 引物 4 μ 1， 禾口 2μ1 50 X Advantage 2 cDNA Polymerase Mix 于 100 μ 1 的反應(yīng)體系中進(jìn)行如下 PCR 循環(huán)95°C預(yù)變性Imin后，以95°C 5s, 65°C 5s, 68°C 6min反應(yīng)沈個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，取 5μ 1電泳檢測(cè)。取50μ 1上述雙鏈cDNA，加入蛋白酶K(20ug/y υ2μ 1，45°C溫育20min， 滅活DNA聚合酶，用100 μ 1等體積苯酚/氯仿/異戊醇(1 1 1 )，氯仿/異戊醇(1:1)各抽提1次，上清夜經(jīng)醋酸鈉，糖原，酒精共沉淀后，80%的酒精漂洗，風(fēng)干后溶解于79 μ 1滅菌雙蒸水中，加入SfiI酶(20υ/μ 1)10μ 1，IOXsfiI緩沖液10 μ 1及1μ 1100XBSA，總體積 100 μ 1，50°C酶切池。酶切產(chǎn)物用CHROMA SPIN-400柱進(jìn)行分級(jí)分離，收集1_16管，每管1 滴。分別取3 μ 1于1. 1%的瓊脂糖凝膠上150V電泳lOmin，收集含cDNA前3管，混合后加入醋酸鈉，糖原和酒精共沉淀，沉淀的cDNA用滅菌雙蒸水溶解。合成的SMART cDNA連接入pDNR-LIB載體中，并轉(zhuǎn)化入DH5 α感受態(tài)細(xì)胞中。涂平板(內(nèi)含氯霉素、異丙基硫代- β -D-半乳糖苷(IPTG)及5-溴-4-氯-3-吲哚- β -D-半乳糖苷(X-gal)，37 °C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜。3.質(zhì)粒文庫(kù)隨機(jī)篩選及測(cè)序
通過(guò)藍(lán)白斑鑒定后隨機(jī)篩選含cDNA插入片段的陽(yáng)性重組子，將挑取的每個(gè)單克隆子分別接種到Iml氯霉素抗性的LB培養(yǎng)液中，搖菌2個(gè)小時(shí)，菌液PCR確認(rèn)陽(yáng)性克隆子，剔除假陽(yáng)性克隆子。將經(jīng)過(guò)菌液PCR鑒定的陽(yáng)性克隆子寄送華大基因公司測(cè)序，測(cè)序在ABI 3730測(cè)序儀上進(jìn)行。在Genbank中對(duì)測(cè)得的序列進(jìn)行Blast同源比對(duì)，鑒定到α類趨化因子基因 CXCL10，該基因cDNA全長(zhǎng)為1157bp，自74bp到44^p區(qū)段為其開(kāi)放閱讀框，編碼122個(gè)氨基酸，5’端非編碼區(qū)長(zhǎng)73bp，3’端非編碼區(qū)長(zhǎng)7Kbp，包含1個(gè)mRNA半衰期信號(hào)，多聚腺苷酸加尾信號(hào)AATAAA和多聚腺苷酸尾巴。4.十個(gè)正常組織和經(jīng)鰻弧菌刺激的肝臟、脾臟和腎臟組織總RNA提起和熒光定量PCR反應(yīng)。利用Trnzol-A+總RNA提取試劑盒提取鯢魚鰾、眼球、鰭條、鰓、心臟、小腸、 腎臟、肝臟、肌肉、脾臟以及經(jīng)鰻弧菌刺激的不同時(shí)間點(diǎn)肝臟、脾臟和腎臟組織的總RNA， 利用Quant cDNA第一鏈合成試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 反應(yīng)。用鯢魚的 β-actin 基因(上游引物5，-GTGATGAAGCC CAGAGCA-3，(SEQ ID NO. 5)；下游引物5，-CGACCAGAGGCATACAGG-3，(SEQ ID NO. 6))作為對(duì)照，確證各個(gè)組織逆轉(zhuǎn)錄的效率都符合要求。CXCLlO基因的熒光定量PCR引物為CXCL10-RT-F (上游引物)5，-GCCTTTCTCGTCTGCCTGCTT-3，(SEQ ID NO. 3) ； CSX10-RT-R (下游引物) 5，-CCGAGTGGTGAGCGTGGATT-3，(SEQ ID NO. 4)。熒光定量反應(yīng)程序模板設(shè)置為 ddCt (Relative Quantitation)Study，反應(yīng)條件設(shè)置為95 度 20s ；95 度 5s，60 度 30s，共 40 個(gè)循環(huán)。利用2_ΔΔσ法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。發(fā)明人運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)了 CXCLlO在鯢魚的鰾、眼球、鰭條、鰓、心臟、小腸、腎臟、肝臟、肌肉、脾臟中的轉(zhuǎn)錄本水平，結(jié)果表明該基因在所檢測(cè)的十個(gè)組織中均有mRNA轉(zhuǎn)錄本存在，其中在小腸中的豐度最高，其次在眼球中，而在其他組織中則只檢測(cè)到較少量的mRNA轉(zhuǎn)錄本存在(如圖1所示)。另外還檢測(cè)到經(jīng)鰻弧菌刺激后的脾臟和腎臟中的CXCLlO基因表達(dá)量呈上升趨勢(shì)，明顯較正常水平高，這提示該基因在鯢魚抵抗病原微生物入侵中具有重要功能(如圖2-1、2-2和2-3所示)。盡管發(fā)明人已經(jīng)對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案做了較為詳細(xì)的闡述和列舉，應(yīng)當(dāng)理解，對(duì)于本領(lǐng)域一個(gè)熟練的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，對(duì)上述實(shí)施例作出修改和/或變通或者采用等同的替代方案是顯然的，都不能脫離本發(fā)明精神的實(shí)質(zhì)，本發(fā)明中出現(xiàn)的術(shù)語(yǔ)用于對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案的闡述和理解，并不能構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的限制。
權(quán)利要求
1.一種鯢魚α類趨化因子基因CXCL10，具有如SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列。
2.一種鯢魚α類趨化因子基因CXCL10，它編碼的蛋白質(zhì)具有如SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列。
3.一種鯢魚α類趨化因子基因CXCLlO的檢測(cè)方法，其特征在于，所述的檢測(cè)方法至少包括使用一對(duì)熒光定量PCR引物，所述的一對(duì)熒光定量PCR引物由上游引物和下游引物組成，其中，所述的上游引物具有如SEQ ID NO. 3所示的核苷酸序列；下游引物具有如SEQ ID NO. 4所示的核苷酸序列。
4.如權(quán)利要求1或2所述的一種鯢魚α類趨化因子基因CXCLlO在制備鯢魚抵抗病原微生物入侵產(chǎn)品中的應(yīng)用。
5.如權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的病原微生物包括鰻弧菌。
全文摘要
本發(fā)明涉及魚類免疫器官中表達(dá)的基因序列領(lǐng)域，具體是一種鮸魚α類趨化因子基因CXCL10、檢測(cè)方法和應(yīng)用。本發(fā)明的基因的獲得不僅為研究魚類趨化因子CXCL10分子在先天免疫反應(yīng)中的作用機(jī)理奠定基礎(chǔ)，而且通過(guò)基因序列可以獲得具有生物活性的蛋白產(chǎn)物，為進(jìn)一步研究CXCL10的免疫學(xué)功能提供理論基礎(chǔ)；此外，本發(fā)明的基因還可以用于抗病相關(guān)性研究，該基因在鮸魚抵抗病原微生物入侵中具有重要功能。
文檔編號(hào)A61P31/04GK102250915SQ20111013987
公開(kāi)日2011年11月23日 申請(qǐng)日期2011年5月27日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月27日
發(fā)明者孫悅娜, 徐田軍, 王日昕, 石戈, 程遠(yuǎn)志 申請(qǐng)人:浙江海洋學(xué)院