專利名稱：：利用大孔樹脂制備細(xì)梗香草總皂苷提取物的方法及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種植物提取物的制備方法，尤其涉及一種利用大孔樹脂制備細(xì)梗香草總皂苷提取物的方法及用途。
背景技術(shù)：
：細(xì)梗香草，又名排草、香排草、香草、毛柄珍珠菜，系報春花科(Primulaceae)珍珠菜屬植物，主要分布在我國西南華南地區(qū)。民間用于治療感冒咳喘、風(fēng)濕痛、抗腫瘤、月經(jīng)不調(diào)、神經(jīng)衰弱、補(bǔ)虛、驅(qū)蛔。關(guān)于細(xì)梗香草的活性成分研究，多為田景奎教授研究，國內(nèi)外少見報道，通過對細(xì)梗香草全草化學(xué)成分進(jìn)行了研究，從中共分離得到了16個化合物，包括13個皂苷和3個黃酮，13個皂苷均為新化合物。包括三種類型皂苷元，其中兩種皂苷元3卩,16a,22a-三羥基-28—13-內(nèi)酯-齊墩果烷和3卩,22a-二羥基-15a，16a-環(huán)氧-齊墩果-12-烯為首次報道，糖有三糖、四糖、五糖。對細(xì)梗香草總皂苷進(jìn)行抗腫瘤活性研究，發(fā)現(xiàn)細(xì)梗香草總皂苷有非常強(qiáng)的抑制卵巢癌細(xì)胞A2780細(xì)胞的作用(IC500.1//g/mL)，有很好的開發(fā)前景。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種利用大孔樹脂制備細(xì)梗香草總皂苷提取物的方法及用途。本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的一種利用大孔樹脂制備細(xì)梗香草總皂苷提取物的方法，該方法為取細(xì)梗香草藥材粉碎或用細(xì)梗香草飲片，加入質(zhì)量體積比為615倍量的水或含水乙醇，含水乙醇中乙醇的體積比為10%-95%，加熱回流提取24次，每次l3h，過濾，合并提取液，濃縮至相對密度Ll1.3;過濾或離心后通過填充有大孔樹脂的層析柱，提取液中的細(xì)梗香草總皂苷與大孔樹脂的重量比為1:510，上柱流速14BV/h，樹脂徑高比為1:31:9;用水洗滌大孔樹脂38BV，洗脫流速為234BV/h，水洗脫液棄去；用體積比為2095%含水乙醇洗脫大孔樹脂，流速為24BV/h，收集乙醇洗脫液；乙醇洗脫液減壓濃縮至相對密度為1.11.25，減壓或噴霧干燥，得細(xì)梗香草總皂苷提取物。進(jìn)一步地，所述的大孔樹脂為聚苯乙烯型大孔樹脂。一種上述方法制備的細(xì)梗香草總皂苷提取物在用于制備治療腫瘤的藥物方面的用途。本發(fā)明的有益效果是本發(fā)明采用的大孔樹脂對細(xì)梗香草總皂苷的吸附量大，被解吸完全，所得總皂苷的含量高，因此，可以顯著提高細(xì)梗香草總皂苷的提取率，降低生產(chǎn)成本。細(xì)梗香草總皂苷提取物具有顯著的抗腫瘤作用，可以用于制備治療腫瘤的藥物。具體實施例方式大孔吸附樹脂是指由苯乙烯、a-甲基苯乙烯、甲基丙烯酸甲酯、丙腈等為原料加入一定量致孔劑二乙烯苯聚合而成的球狀顆粒，直徑一般在0.3-1.25mm之間。本發(fā)明細(xì)梗香草總皂苷提取物的制備方法為取細(xì)梗香草藥材粉碎或用細(xì)梗香草飲片，加入質(zhì)量體積比為615倍量的水或含水乙醇，含水乙醇中乙醇的體積比為10%-95%，加熱回流提取24次，每次l3h,過濾，合并提取液，濃縮至相對密度Ll1.3;過濾或離心后通過填充有大孔樹脂的層析柱，提取液中的細(xì)梗香草總皂苷與大孔樹脂的重量比為1:510，上柱流速l4BV/h，樹脂徑高比為1:31:9;用水洗滌大孔樹脂38BV，洗脫流速為24BV/h，水洗脫液棄去；用體積比為2095%含水乙醇洗脫大孔樹脂，流速為24BV/h，收集乙醇洗脫液；乙醇洗脫液減壓濃縮至相對密度為1.11.25，減壓或噴霧干燥，得細(xì)梗香草總皂苷提取物。其中，離心的轉(zhuǎn)速為400016000轉(zhuǎn)/分鐘；大孔樹脂為聚苯乙烯型大孔樹脂。上述方法得到的提取物中細(xì)梗香草總皂苷重量含量為20%70%、細(xì)梗香草苷B重量含量不低于10%。細(xì)梗香草總皂苷的抗腫瘤實驗體外抗腫瘤細(xì)胞篩選實驗.實驗方法a細(xì)胞培養(yǎng)運用組織細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)培養(yǎng)各類腫瘤細(xì)胞，細(xì)胞接種于含10%新生牛血清RPMI-1600培養(yǎng)液中。培養(yǎng)環(huán)境為5%(:02，37'C及飽和濕度。細(xì)胞傳代為23d。貼壁細(xì)胞以0.25%胰蛋白酶消化適當(dāng)后l:3傳代。懸浮細(xì)胞離心收集后傳代。b.體外細(xì)胞生長抑制實驗(MTT法)取對數(shù)生長期的人癌細(xì)胞(0.5-1.0)xl()S/mL，分裝于96孔培養(yǎng)板中，0.2mL/孔。實驗設(shè)陰性對照組、溶劑對照組、陽性藥(Taxol)組和5-6個不同濃度細(xì)梗香草藥物組。藥物與細(xì)胞培養(yǎng)72h，在實驗結(jié)束前4h每孔加入20ulMTF液(5ug/mL)。4h后吸棄培養(yǎng)液，待結(jié)晶溶解后置酶聯(lián)檢測儀，用570nm波長測各孔的吸光度值(A)，按下列公式求生長抑制率，并用POMS軟件程序求出半數(shù)抑制濃度(IC50)，進(jìn)行評價和比較。生長抑制輛T^^x腦試驗中釆用的人食道癌細(xì)胞Eca-109,人胃癌細(xì)胞BGC-823，腸癌C38，白血病細(xì)胞Molt-4，肺癌細(xì)胞株A549，結(jié)腸腺癌細(xì)胞HCT-8，宮頸癌細(xì)胞HeLa，肝癌H22，卵巢癌A2780,乳腺癌MCF7，S哪肉瘤，人口腔上皮癌細(xì)胞KB等十二種瘤株進(jìn)行了ICso測定。對鼠源性瘤株體內(nèi)抑制作用選取腹腔傳代7d，腹部膨隆明顯的Swo肉瘤、肝癌H22和結(jié)腸癌細(xì)胞株colon26小鼠，在超凈工作臺中，腹部皮膚消毒，用一次性無菌采血器經(jīng)腹壁刺入腹腔，抽取腹水，放入無菌燒杯中，以生理鹽水稀釋成1:3的癌細(xì)胞混懸液，鏡下觀察計數(shù)，并調(diào)整瘤細(xì)胞濃度至lxl07/mL。接種于18-22gICR小鼠右側(cè)腋部皮下0.2mL/只。接瘤次日，將實驗小鼠隨機(jī)分為對照組(生理鹽水20mL/kg);CTX組(30mg/kg);細(xì)梗香草皂苷組5mg/kg、10mg/kg和20mg/kg三個給藥劑量組，共5組，每組10只。每天灌胃給藥l次，隔日稱量體重l次,連續(xù)給藥10d，每天觀察ICR小鼠反應(yīng)情況，包括進(jìn)食、大小便性狀、精神狀態(tài)等。停藥次日，將動物稱重后脫臼處死，剝離出皮下腫塊稱重，比較各組間腫瘤重量的差異性。并計算出腫瘤抑制百分率。統(tǒng)計學(xué)處理方法采用組間t-檢驗。腫瘤抑制率:對照組平^t^l平均瘤重y對照組平均瘤重結(jié)果5實驗表明除肺癌細(xì)胞株A549和乳腺癌MCF7外，細(xì)梗香草皂苷對其它IO種腫瘤細(xì)胞均有較好的抑制作用。見表l表1:細(xì)梗香草皂苷體外對12種瘤株的抑制作用<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>細(xì)梗香草皂苷對鼠源性瘤株抑制效果見表2、表3和表4。實驗表明細(xì)梗香草皂苷對三種移植性鼠源性瘤株均有較好的抑制作用，特別對結(jié)腸癌細(xì)胞株colon26移植瘤抑制率超過50%。表2:細(xì)梗香草皂苷對小鼠S180移植瘤的抑制作用<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>與模型對照組比較<0.05"PO.Ol表3:細(xì)梗香草皂苷對小鼠H^移植瘤的抑制作用組別例劑體重(g)瘤重抑瘤數(shù)里(g)率nmg/kg實驗前實驗后X土S%陰性對照組(生理鹽20.57±0.水)10等體積96細(xì)梗香草24.84土1.7皂苷10208細(xì)梗香草20.18±1.皂苷101013細(xì)梗香草皂苷105環(huán)磷酰胺組(CTX)103020.4±0.8823.97土1.1與模型對照組比較4<0.05，"PO.01表4:細(xì)梗香草皂苷對小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞株cokm26移植瘤的抑制作用^組別例卞/,數(shù)劑量體重(g)瘤重(g)抑瘤率nmg/kg實驗前實驗后X土S%陰性對照組(生理鹽等體18.6±0.水)10積728.3±3.21.83±0.43細(xì)梗香草皂苷102018.7±0.425.9±1.80.80±0.3351.3**細(xì)梗香草皂苷101020.2±1.430.7±2.51.59±0.2629.5細(xì)梗香草皂苷10519.8±0.828.8±2.31.77±0.286.87環(huán)磷酰胺組20.5±1.30(CTX)10_J_27.2±3.20.89±0.2550.7**與模型對照組比較^P0.05"P<0.01實施例1取粉碎后的細(xì)梗香草藥材2kg，加6倍量水，加熱回流提取2次，每次lh，過濾，合并提取液，濃縮至相對密度l.l;過濾后通過DHM型大孔樹脂，提取液按細(xì)梗香草總皂苷含量計與干樹脂的重量比為1:5,上柱流速lBV/h，樹脂徑高比為1:3;用水洗滌樹脂3BV，洗脫流速為2BV/h，水洗脫液棄去；用含20%含水乙醇洗脫8BV,流速為2BV/h，收集乙醇洗脫液；乙醇洗脫液減壓濃縮至相對密度為1.1，減壓干燥，得細(xì)梗香草總皂苷提取物。測得細(xì)梗香草總皂苷含量為20%,細(xì)梗香草皂苷B含量為10.2%。實施例2將細(xì)梗香草飲片lkg，加15倍量95%乙醇，加熱回流提取4次，每次3h，過濾，合并提取液，濃縮至相對密度1.3;離心后通過AB-8型大孔樹脂的層析柱，提取液按細(xì)梗香草總皂苷含量計與干樹脂的重量比為1:10,上柱流速4BV/h，樹脂徑高比為1:9;用水洗滌樹脂8BV，洗脫流速為4BV/h，水洗脫液棄去；用含95%含水乙醇洗脫，流速為4BV/h，收集乙醇洗脫液；乙醇洗脫液減壓濃縮至相對密度為1.25，減壓或噴霧干燥，得細(xì)梗香草總皂苷提取物。測得細(xì)梗香草總皂苷含量為70%,細(xì)梗香草皂苷B含量為55%。實施例3取粉碎后的細(xì)梗香草藥材5kg，加8倍量70%，加熱回流提取2次，每次1.5h，過濾，合并提取液，濃縮至相對密度1.2;離心(4000轉(zhuǎn)/分鐘)后通過AB-8型大孔樹脂，藥液按細(xì)梗香草總皂苷含量計與干樹脂的重量比為1:5，上柱流速2BV/h，樹脂徑高比為1:5;用水洗滌樹脂3BV，洗脫流速為4BV/h，水洗脫液棄去；用含70%水乙醇洗脫3BV，流速為2BV/h，收集乙醇洗脫液；乙醇液減壓濃縮至相對密度為1.1(50'C熱測)，減壓干燥，得細(xì)梗香草總皂苷提取物。測得細(xì)梗香草總皂苷含量為60%，細(xì)梗香草皂苷B含量為25%。實施例4細(xì)梗香草藥材飲片5kg，加10倍量10%乙醇，加熱回流提取3次，每次1.0h，過濾，合并提取液，濃縮至相對密度1.15;過濾后通過D2。,型大孔樹脂，藥液按細(xì)梗香草總皂苷含量計與干樹脂的重量比為1:9,上柱流速3BV/h，樹脂徑高比為1:7;用水洗滌樹脂5BV，洗脫流速為4BV/h，水洗脫液棄去；用含50%水乙醇洗脫IOBV，流速為4BV/h，收集乙醇洗脫液；乙醇液減壓濃縮至相對密度為1.25(50'C熱測)，噴霧干燥，得細(xì)梗香草總皂苷提取物。測得細(xì)梗香草總皂苷含量為55。％，細(xì)梗香草皂苷B含量為10.6%。實施例5細(xì)梗香草藥材飲片5kg，加15倍量水，加熱回流提取2次，每次lh,過濾，合并提取液，濃縮至相對密度1.25;離心(8000轉(zhuǎn)/分鐘)后通過HPD450大孔樹脂，藥液按細(xì)梗香草總皂苷含量計與干樹脂的重量比為1:6，上柱流速4BV/h，樹脂徑高比為1:9;用水洗滌樹脂2BV，洗脫流速為3BV/h，水洗脫液棄去；用含50X水乙醇洗脫5BV，流速為3BV/h，收集乙醇洗脫液；乙醇液減壓濃縮至相對密度為1.2(5(TC熱測)，噴霧干燥，得細(xì)梗香草總皂苷提取物。測得細(xì)梗香草總皂苷含量為45%，細(xì)梗香草皂苷B含量為13.5%。權(quán)利要求1、一種利用大孔樹脂制備細(xì)梗香草總皂苷提取物的方法，其特征在于，該方法為取細(xì)梗香草藥材粉碎或用細(xì)梗香草飲片，加入質(zhì)量體積比為6～15倍量的水或含水乙醇，含水乙醇中乙醇的體積比為10％-95％，加熱回流提取2～4次，每次1～3h，過濾，合并提取液，濃縮至相對密度1.1～1.3。過濾或離心后通過填充有大孔樹脂的層析柱，提取液中的細(xì)梗香草總皂苷與大孔樹脂的重量比為1∶5～10，上柱流速1～4BV/h，樹脂徑高比為1∶3～1∶9。用水洗滌大孔樹脂3～8BV，洗脫流速為2～4BV/h，水洗脫液棄去。用體積比為20～95％含水乙醇洗脫大孔樹脂，流速為2～4BV/h，收集乙醇洗脫液；乙醇洗脫液減壓濃縮至相對密度為1.1～1.25，減壓或噴霧干燥，得細(xì)梗香草總皂苷提取物。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述利用大孔樹脂制備細(xì)梗香草總皂苷提取物的方法，其特征在于，所述的大孔樹脂為聚苯乙烯型大孔樹脂。3、一種權(quán)利要求1所述方法制備的細(xì)梗香草總皂苷提取物用于制備治療腫瘤的藥物方面的用途。全文摘要本發(fā)明公開了一種利用大孔樹脂制備細(xì)梗香草總皂苷提取物的方法及用途，它是將細(xì)梗香草藥材粉碎或直接用細(xì)梗香草飲片，加質(zhì)量體積比為6～15倍量水或體積比為10％～95％乙醇，加熱回流提取，過濾，合并提取液，濃縮；過濾或離心后通過填充有大孔樹脂的層析柱，先用水洗滌樹脂，水洗脫液棄去；再用含水乙醇洗脫，收集乙醇洗脫液；乙醇洗脫液減壓濃縮，減壓或噴霧干燥，得細(xì)梗香草總皂苷。本發(fā)明采用的大孔樹脂對細(xì)梗香草總皂苷的吸附量大，被解吸完全，所得總皂苷的含量高，因此，可以顯著提高細(xì)梗香草總皂苷的提取率，降低生產(chǎn)成本。細(xì)梗香草總皂苷提取物具有顯著的抗腫瘤作用，可以用于制備治療腫瘤的藥物。文檔編號A61P35/00GK101507740SQ20091009678公開日2009年8月19日申請日期2009年3月19日優(yōu)先權(quán)日2009年3月19日發(fā)明者付紅偉,應(yīng)弘梅,琳張,欣王,田富饒,田景奎,鄭筱祥申請人:浙江大學(xué)