專(zhuān)利名稱(chēng)：冬凌草莖水提物、其制備方法、指紋圖譜及作為自由基清除劑的應(yīng)用的制作方法
冬凌草莖水提物、其制備方法、指紋圖譜及作為自由基清除劑的應(yīng)用發(fā)明領(lǐng)域
本發(fā)明涉及冬凌草莖用蒸餾水80°C提取制備水提物、涉及該水提物的HPLC-(-)ES1-Q-TOF-MS/MS指紋圖譜、涉及該水提物的HPLC-(+) ES1-Q-TOF-MS/MS指紋圖譜、進(jìn)一步涉及該水提物作為自由基清除劑的應(yīng)用。本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
輻射、農(nóng)藥、食物添加劑、酒精、吸煙、新陳代謝、缺氧以及激烈的運(yùn)動(dòng)都會(huì)使人體產(chǎn)生自由基。人體內(nèi)的自由基主要有氧自由基、羥自由基和氮氧自由基。自由基可以引發(fā)多種疾病。例如自由基可損傷細(xì)胞膜導(dǎo)致細(xì)胞膜變性、可造成基因突變誘發(fā)癌癥、可激活免疫系統(tǒng)引起紅斑狼瘡等自體免疫疾病、可增加毛細(xì)血管脆性導(dǎo)致靜脈曲張和水腫、可激發(fā)各種炎癥因子釋放引起非菌性炎癥、可損傷腦細(xì)胞引起老性癡呆、可氧化血液脂蛋白造成膽固醇向血管壁沉積引起動(dòng)脈硬化和和中風(fēng)、可引起關(guān)節(jié)膜及關(guān)節(jié)滑液降解導(dǎo)致關(guān)節(jié)炎以及可損傷胰臟細(xì)胞引起糖尿病等疾病。尋找自由基清除劑是藥物研究的重要方向之一。
冬凌草(DLC),是唇形科香茶菜屬植物碎米極Rabdosia rubescens (Hemsl.) Hara的全草。冬凌草為多年生草本植物，廣泛分布于我國(guó)黃河長(zhǎng)江流域，主產(chǎn)于河南濟(jì)源太行山、王屋山區(qū)一帶。因具有清熱 解毒、清咽利喉和消腫止痛功能，民間常年將冬凌草葉當(dāng)作茶葉煮水飲用。在過(guò)去的30多年里，冬凌草的化學(xué)成分及藥理作用研究主要集中在葉的脂溶性部分，代表性成分為冬凌草甲素和冬凌草乙素。雖然曾經(jīng)有人研究過(guò)冬凌草甲素的自由基清除活性，但是迄今沒(méi)有任何與冬凌草莖的水提物化學(xué)成分及自由基清除作用相關(guān)的研究見(jiàn)諸文獻(xiàn)。與葉相比，冬凌草莖在全草中所占的比例高很多。有效地應(yīng)用冬凌草莖保護(hù)人體免受自由基損傷有重要意義。
通過(guò)長(zhǎng)期的自由基清除劑研究積累，發(fā)明人鎖定酚酸與二萜是具有自由基清除活性的結(jié)構(gòu)類(lèi)型。通過(guò)生源分析發(fā)明人預(yù)測(cè)到冬凌草莖中含豐富的酚酸與二萜。按照這些認(rèn)識(shí),發(fā)明人提出本發(fā)明，用 HPLC- (-) ES1-Q-TOF-MS/MS 和 HPLC- (+) ES1-Q-TOF-MS/MS 指紋圖譜指紋圖譜揭示冬凌草莖水提物的化學(xué)成分、用自由基清除模型揭示冬凌草莖水提物的自由基清除作用。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的第一個(gè)技術(shù)問(wèn)題是提供一種制備冬凌草莖水提物的方法。
本發(fā)明所要解決的第二個(gè)技術(shù)問(wèn)題是建立HPLC-㈠ES1-Q-TOF-MS/MS和HPLC-(+)ES1-Q-TOF-MS/MS分析方法，獲取冬凌草莖水提物的指紋圖譜以便控制冬凌草莖水提物的質(zhì)量。
本發(fā)明所要解決的第三個(gè)技術(shù)問(wèn)題是用由基清除模型評(píng)價(jià)冬凌草莖水提物的由基清除作用，為預(yù)防由基清除引起的疾病提供冬凌草莖水提物作為自由基清除活性高無(wú)副作用的物質(zhì)。
本發(fā)明涉及冬凌草莖水提物的制備工藝，該工藝包括冬凌草莖用熱水提取、水提物過(guò)濾、濾液減壓濃縮至干、得到的干粉用HPLC-㈠ES1-Q-TOF-MS/MS和HPLC- (+)ES1-Q-TOF-MS/MS分析得指紋圖譜、得到的干粉用由基清除模型評(píng)價(jià)冬凌草莖水提物的由基清除作用。
為了進(jìn)一步闡述本發(fā)明，下面給出一系列實(shí)施例。這些實(shí)施例完全是例證性的，它們僅用來(lái)對(duì)本發(fā)明進(jìn)行具體描述，不應(yīng)當(dāng)理解為對(duì)本發(fā)明的限制。


圖1a冬凌草莖水提物在(_)ES1-Q-TOF-MS檢測(cè)的離子流指紋圖譜
圖1b冬凌草莖水提物在(+) ES1-Q-TOF-MS檢測(cè)的離子流指紋圖譜
圖2a，b冬凌草莖水提物清除DPPH自由基的作用
圖3a，b冬凌草莖水提物清除羥自由基的作用具體實(shí)施方式
實(shí)施例1冬凌草莖水提物的制備
40g干冬凌草莖自來(lái)水洗凈、涼干、切成大約Icm長(zhǎng)的莖段、加1000_1800mL溫度為70-900C的熱蒸鎦水滲濾，優(yōu)選加1200mL溫度為80°C的熱蒸鎦水滲濾。滲濾液流出的速度為10-30mL/分鐘，優(yōu)選20mL/分鐘。流出液于40_60°C減壓濃縮，優(yōu)選于50°C減壓濃縮，得到3g冬凌草莖水提物，為淡黃色固體。研成粉末，供后面的研究使用。
實(shí)施例2冬凌草莖水提物的HPLC-㈠ES1-Q-TOF-MS/MS指紋圖譜和HPLC- (+)ES1-Q-TOF-MS/MS 指紋圖譜
HPLC:ffaters 2795Separations Module ；
Detector:ffaters 2489Dual absorbance detector ；
Kromasil C18 (Dikma)反相柱(5_ μ m, 250_mm_X_4.6_mm)；
保護(hù)柱(5_μ m, 10_mm_X_4.6_mm)；
流動(dòng)相:乙腈/水(含0.5%和0.05%冰醋酸)；
流動(dòng)相流速:0.3ml/min ；
進(jìn)樣量:50yL;
洗脫方式:梯度洗脫(具體梯度見(jiàn)表I)。
表I冬凌草莖水提 物HPLC-分析流動(dòng)相梯度表a
權(quán)利要求
1.冬凌草莖水提物的制備工藝，該工藝包括將干冬凌草莖用自來(lái)水洗凈之后切碎，按I: 40 (g/mL)的比例用70-90°C的熱水滲濾，滲濾液流出的速度為10-30mL/分鐘，流出液于40-60°C減壓濃縮，得到冬凌草莖水提物干粉。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中干冬凌草莖與用于滲濾的熱水的比例為I: 30(g/mL)ο
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中用于滲濾的熱水的溫度為80°C。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中滲濾液流出的速度為20mL/分鐘。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中流出液減壓濃縮的溫度為50°C。
6.權(quán)利要求1-6的任一方法制備得到的冬凌草莖水提物，其特征在于該冬凌草莖水提物減壓濃縮得到的干粉為淡黃色固體。
7.冬凌草莖水提物的HPLC-PAD/(-)ES1-MS-MS指紋圖譜。
8.冬凌草莖水提物的HPLC-PAD/(+)ES1-MS-MS指紋圖譜。
9.冬凌草莖提物作為自 由基清除劑的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及冬凌草莖用蒸餾水80℃提取制備水提物、涉及該水提物的HPLC-(-)ESI-Q-TOF-MS/MS指紋圖譜、涉及該水提物的HPLC-(+)ESI-Q-TOF-MS/MS指紋圖譜、進(jìn)一步涉及該水提物作為自由基清除劑的應(yīng)用。
文檔編號(hào)A61K135/00GK103142689SQ201110406570
公開(kāi)日2013年6月12日 申請(qǐng)日期2011年12月7日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月7日
發(fā)明者彭師奇, 趙明, 姚興河, 唐靜成, 彭莉 申請(qǐng)人:彭莉